魚病細菌に対する赤血球膜糖タンパク質グリコホリンの生体防御機能の研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660184
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 青木 恭彦 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (00212366)
• Keywords: 赤血球膜 / 糖タンパク質 / グリコホリン / シアル酸 / 糖鎖 / 魚類

Research Abstract

健全なコイの背部動脈から血液をシリンジを用いて採取し、直ちに白血球および血漿を遠心分離によって分離した後、得られた赤血球から赤血球膜の調製を行った。コイは常時蓄養し、1回に60-100mlの血液を分取し、その日の内に赤血球膜調製を行った。調製した赤血球膜は緩衝液に懸濁した後、-20℃で凍結して保存した。集めた赤血球膜(血液約500ml分)を凍結乾燥した後、LIS-フェノール法を用いてグリコホリンを調製した。単離したグリコホリンをSDS-PAGEで純度を検討した結果、均一に単離されたと判断した。次に単離したグリコホリン標品を用いて病原性細菌との親和性を検討した。用いた魚病性細菌は、コイなどで発病する立鱗病、赤斑病、鰭赤病などの原因菌であるAeromonas hydrophila、細菌性白雲病のPseudomonas fluorescens、ウナギのパラコロ病などの原因病である
Edwardsiella tarda、ビブリオ病のVibrio anguillarum、グラム陽性で抗菌検査に用いられるBacillus subtilisやMicrococcuss luteusなどである。その結果、顕微鏡下では親和性が確認できなかったが、電子顕微鏡で観察した結果、グリコホリン凝集体が菌体と作用している様子が観察された。次に、得られたグリコホリンから糖鎖を遊離させ、糖鎖用陰イオン交換カラムを用いたHPLC法を用いて糖鎖を検出した。その結果、シアル酸が1つ結合したオリゴ糖と2つ結合したオリゴ糖に分別できた。これらの糖鎖をHPLCを用いて分取した。分取・脱塩の操作途中でシアル酸が脱落したが、最終的に各糖鎖を400μg程度調製する事が出来た。次いで調製した糖鎖の核磁気共鳴(NMR)スペクトルを測定した。その結果、中性糖が4つ結合したオリゴ糖であることが判明したが、それぞれの結合様式は推測の域を出ず、さらにメチル化およびGC/MSによる確認が必要であった。しかし、糖鎖の絶対量が最低でも200μg必要なため、現在シアル酸付加糖鎖の大量分取を鋭意行っている最中である。