ウシ凍結乾燥精子の卵細胞質内精子注入による受精と胚発生

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12660258
• Research Institution: HIROSHIMA PREFECTURAL UNIVERSITY
• Principal Investigator: 堀内 俊孝 広島県立大学, 生物資源学部, 助教授 (70209279)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山田 學 広島県立大学, 生物資源学部, 教授 (90106005)
• Keywords: 卵細胞質内精子注入法 / ウシ / 凍結乾燥精子 / 精子アスター / 受精 / 胚発生

Research Abstract

ウシ凍結乾燥精子の卵細胞質内精子注入法(ICSI)を確立するため,(1)凍結乾燥における精子浮遊液(CZBまたはNa-EGTA緩衝液)の相違がICSI後の前核形成(PNF),精子アスター形成(SAF),胚発生に及ぼす影響,(2)凍結乾燥精子のICSI後の前核期におけるDNA合成,(3)凍結乾燥精子再水和後のdithiothreitol(DTT)処理がICSI後のPNF, SAF,胚発生に及ぼす影響,(4)再水和後のTriton X-100処理がICSI後のPNFとSAFに及ぼす影響,(5)活性化処理の相違が胚発生に及ぼす影響を調べ,以下の知見が得られた。
(1)CZB凍結乾燥精子のICSIでは卵割率は28%と低く,8細胞期に発生しなかった。一方,Na-EGTA緩衝液での凍結乾燥精子のICSIでは卵割率65%と有意に高く,胚盤胞への発生が観察された(6%)。CZB区とNa-EGTA緩衝液区のPNFに差はなかったが,SAFはNa-EGTA緩衝液で有意に高かった(39% vs.16%)。(2)新鮮精子と比べ凍結乾燥精子のICSIでは異常PNFが高かったが(18% VS.0%),DNA合成率に差はなかった。(3)0〜5mMのDTT処理でPNF, SAFに差はなく,卵割率と胚盤胞率は同様であった。(4)Triton X-100処理でPNFに差はなく(70% VS.61%),SAFは有意に減少した(33% VS.13%)。(5)5μM ionomicin5分と3時間後1.9mM DMAPの3時間活性化処理はICSI後4時間の7%エタノール5分の活性化処理と比べ,有意に高い卵割率(72% VS.59%)と胚盤胞率であった(11% VS.1%)。以上からウシ凍結乾燥精子のICSIによって胚盤胞胚の作出が可能であることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Emuta, C., Horiuchi, T.: "Effects of timing of activation and aging of bovine oocytes fertilized by ICSI on cleavage and subsequent embryonic development in vitro"Journal of Reproduction and Development. 47・6. 399-405 (2001)
• [Publications] 堀内俊孝, 江無田智恵: "ウシにおける卵細胞質内精子注入法(ICSI)の現状と展望"日本胚移植研究会誌. 23・2. 68-76 (2001)
• [Publications] Horiuchi, T., Emuta, C., Yamauchi, Y., Oikawa, T., Numabe, T., Yanagimachi, R.: "Birth of normal calves after intracytoplasmic sperm injection of bovine oocytes : A methodological approach"Theriogenology. 57・3. 1013-1024 (2002)
• [Publications] 堀内俊孝他: "「卵子研究法」(IV-5.顕微受精.5-2.ウシ)"養賢堂. 357-367 (2001)