Caによる細胞膜Naチャネル発現調節機序:サブユニットmRNA変動と細胞内輸送

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670092
• Research Institution: Miyazaki Medical College
• Principal Investigator: 和田 明彦 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (30131949)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 横尾 宏毅 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (30332894) ; 柳田 俊彦 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (60295227) ; 小林 英幸 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (40148953)
• Keywords: Voltage-dependent Na^+ channels / Down-regulation / Ca^<2+>oscillation / Ca^<2+>signaling / Protein kinase / Protein phosphatase / Calpain / Neuroprotective drug

Research Abstract

虚血/低酸素において、電位依存性Na^+チャネルの持続的開孔が、細胞内Ca^<2+> overloadの引き金となり、細胞障害をまねく。今回は、Ca^<2+> overloadと神経保護薬の細胞膜Na^+チャネルの発現量と機能に対する影響を、培養ウシ副腎髄質クロマフィン細胞(発生学的に神経堤に由来する)を用いて検討した。
Ca^<2+>イオノフォア、小胞体Ca^<2+>-ATPase阻害薬(thapsigargin、DBHQ)、calcineurin阻害薬(cyclosporin A、FK506)、BAPTA-AMなどを用いて、細胞内[Ca^<2+>]_i、calcineurin活性を測定し、(1)中程度・比較的長期の[Ca^<2+>]_i上昇は、cPKC-αとcalcineurinを活性化し、dynaminのリン酸化・脱リン酸化とカルパイン活性化を引き起こし、clathrin-coated vesicleによる細胞膜Na^+チャネルの細胞内へのinternalizationを促進した。また、(2)さらに高濃度・長期の持続的[Ca^<2+>]_i上昇は、Na^+チャネルα-およびβ_1-サブユニットmRNAレベルを低下させた。いずれの[Ca^<2+>]_i上昇も細胞膜Na^+チャネルのdown-regulationをおこした。他方、(3)急速・一過性[Ca^<2+>]_i上昇は、Na^+チャネルdown-regulationを起こさなかった。また、(4)calcineurinによる脱リン酸化反応とFKBP-and rapamycin-associated protein(FRAP)によるリン酸化反応は、新しく合成されたNa^+チャネルのtrans-Golgi networkから細胞膜への輸送を抑制的に制御していた。(5)down-regulationされたNa^+チャネルにおいて、^<22>Na^+流入量は低下したが、native Na^+チャネルと同様に、ヴェラトリジン、α-およびβ-サソリ毒、ブレベトキシンによるNa^+チャネルのアロステリックな開孔増強機構は保持されていた。
神経保護薬NS-7は、Na^+チャネルα-サブユニットのドメインIのトランス・メンブレン・セグメント6に結合し、Na^+チャネル開孔を可逆的に阻害し、Ca^<2+>チャネル開孔・カテコールアミン分泌を低下させた。他方、NS-7の慢性投与は、Na^+チャネルα-およびβ_1-サブユニットmRNAレベルを上昇させることなくNa^+チャネルのtrans-Golgi networkからのexternalizationを促進し、また、Na^+チャネルinternalizationを低下させ、細胞膜Na^+チャネル量をup-regulationした。しかし、lipophilicなNS-7は、Na^+チャネル、および、その近傍の細胞膜脂質に非可逆的に結合しており、^<22>Na^+流入量は、むしろ、低下した。アロステリック開孔機構は阻害されなかった。

Research Products

• [Publications] 和田 明彦: "電位依存性Na^+チャネルの細胞膜発現・局在化機構とチャネル病"蛋白質核酸酵素. (in press). (2002)
• [Publications] Kobayashi H et al.: "Regulation of voltage-dependent sodium channel expression in adrenal chromaffin cells : involvement, of multiple calcium signaling pathways"Annals of The New York Academy of Sciences. (in press).
• [Publications] Shiraishi S et al.: "Up-regulation of cell surface sodium channels by cyclosporin A, FK506, and rapamycin in adrenal chromaffin cells."Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 297・2. 657-665 (2001)
• [Publications] Shiraishi S et al.: "Heterogeneous increases of cytoplasmic calcium : distinct effects on down-regulation of cell surface sodium channels and sodium channel subunit mRNA levels"British Journal of Pharmacology. 132・7. 1455-1466 (2001)
• [Publications] Yokoo H et al.: "Short-and long-term differential effects of neuroprotective drug NS-7 on voltage-dependent sodium channels in adrenal chromaffin cells"British Journal of Pharmacology. 131・4. 779-787 (2000)
• [Publications] Yanagita T et al.: "Protein kinase C-α and -ε down-regulate cell surface sodium channels via differential mechanisms in adrenal chromaffin cells"Journal of Neurochemistry. 74・4. 1674-1684 (2000)
• [Publications] Yanagita et al.: "Control and Disease of Sodium Dependent Transport Proteins and Ion Channels"ed by Suketa Y et al., Elsevier Science Press. 185-186 (2000)