2000 Fiscal Year Annual Research Report
クリニカル モレキュラ スキャナによる組織オルガネラ蛋白質の系統的解析法
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12670122
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
村山 季美枝 順天堂大学, 医学部, 助教授 (20053118)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森田 正隆 日立工機, 精機部, 主任技師
藤村 務 順天堂大学, 医学部, 助手 (70245778)
進藤 典子 順天堂大学, 医学部, 助手 (60095809)
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| Keywords | Proteome / Liver Organelle / Nycodenz Density Gradient / Ultracentrifuge / SDS-electrophoresis / Western Blot |
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| Research Abstract |
従来とは異なる概念を用い密度勾配を作成し、オルガネラ分画法を確立した。密度勾配のメヂユムとして造影剤に用いられるNycodenz(NycomedPharmaAS)を使用した。本剤は細胞毒性がなく、Ficollのように膜を通過する性質がなく、酵素の活性を阻害しない利点があり、分画後直ちにマーカー酵素の測定が可能であった。また、本剤は遠心分離による自動密度勾配作成能が利点とされているが、遠心には長時間を要し、十分な勾配形成が出来なかった。我々はNycodenz溶液の凍結融解による完全な密度勾配作成法を開発した。遠心チューブ内にNycodenz溶液を入れ、-20℃に一夜放置後、室温で自然解凍させる事により、十分な密度勾配を形成させた。用いるチューブのサイズ、Nycodenzの濃度により、異なった密度勾配が作成され、目的とするオルガネラに応じて自由に勾配を選択できる事を明らかにした。
10、20,30%Nycodenz液で密度勾配作成後、ラット肝臓のホモジネイトを試料として、超遠心分離し、フラクショネーターで分画した。各チューブの密度を測定後、一部を1次元SDS-PAGEで蛋白質分離を試みた。蛋白質パターンは密度変化に相関しており、蛋白質パターンから密度が推測出来た。また、2種の酵素活性測定及び4種の抗体によるオルガネラの同定を試みたが、後者ではオルガネラの広がりや、重なりを容易に判定出来た。リソゾームとミトコンドリアは分離が難しく、今後、遠心管サイズおよびNycodenz濃度の検討を必要とした。しかしながら、本法において両者の分画はわずかにずれており、両者の重なりが少ない部分の分画物を二次元電気泳動で比較したところ、夫々に特異的な蛋白質スポットが確認された。One Step分画ですべてのオルガネラに存在する蛋白質を俯瞰できるNycodenzによる密度勾配分画法はプロテオーム解析の前処理法として、欠くべからざるものであることが明確になった。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] Hikari Taka et al.: "Rapid Determination of Parvalbumin Amino Acid Sequence from Rana catesbeniana (pI4.78) by Combination of ESI Mass Spectrometry, Protein Sequencing, and Amino Acid Analysis"J.Biochem.. 127. 723-729 (2000)
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[Publications] Noriko Shindo et al.: "Ion-Pair Chromatography for Identification of Picomolar-Order Protein on a PVDF Membrane"Methods in Molecular Biology : Amino Acid Analysis Protocols. 159. 87-100 (2000)
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[Publications] Kimie Murayama et al.: "Characterization of Native and Recombinant peptidyl prolyl cis-trans isomerases derived from Methanococcus thermolithotrophicus based on cDNA sequenes"Electrophoresis. 21. 1733-1739 (2000)
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[Publications] Takuya Nagata et al.: "Possible Involved of Cyclophilin B and Caspase-Activated Deoxyribonuclease in the induction of Chromosol DNA Degradation in TCR-stimulated Thymocyte"J.Immunol.. 165. 4281-4289 (2000)
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[Publications] Hisako Amino et al.: "Stage-specific isoforms of Ascaris suum complexII : the fumarate reductase of the parasitic adult and the succinate dehydrogenase of free-living larvae share a common iron-sulfur subunit"Mol.Biochem.Parasitol.. 106. 63-76 (2000)
