環境水から検出されるクリプトスポリジウムの分子生物学的手法による種及び型の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670385
• Research Institution: OSAKA PREFECTURAL INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH
• Principal Investigator: 木村 明生 大阪府立公衆衛生研究所, 公衆衛生部, 主任研究員 (00250283)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井関 基弘 金沢大学, 医学部・寄生虫学教室, 教授 (20047179)
• Keywords: クリプトスポリジウム / PCR / in situ hybridization / 環境水 / 凝集沈殿法

Research Abstract

1.Cryptospridium. Parvum特異的遺伝子検出の検討
オーシストの形態及び抗原性を維持したまま、蛍光抗体法と同時にC.parvum遺伝子を検出することを目的として、in situ hybridization法の検討を行った。C.parvum特異的なSSUrRNA配列を直接標的とするRhodamin標識プローブを数種類作製し、通常人に病原性を示さないC.muris及びC.bailei like isolateを陰性対照として用いて実験した。その結果、このうちの1種類のプローブで蛍光顕微鏡下の観察において、種間で蛍光強度に若干の差異が認められた。しかし、これを直ちに通常の検査に用いるにはシグナルの強度が不十分であると考えられた為、更にC.parvumのSSUrRNA遺伝子の一部を増幅させるPCR用プライマーを設計し、in situ PCR / hybridization法の開発を目的として検討を行った。その際、Taq polymeraseには反応サイクル時間の短いZ Taqを用い、オーシストへの熱によるダメージを少なくした。その結果、intactなオーシスト内での目的遺伝子断片の増幅を確認する事ができた。この結果は、in situ PCR / hybridization法による蛍光抗体スライド上でのC.parvum遺伝子の検出へ応用出来ると考えられた。
2.クリプトスポリジウム・オーシストの環境水からの濃縮法についての検討
硫酸第二鉄凝集沈殿法が、環境水、特に水道水から少数のオーシストを高率に検出出来る事が明らかとなった。さらに同法は、オーシストの生存に大きな影響を与えない事が明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Karanis, P., Papadopoulou, C., Kimura, A., Economou, B.: "Distribution of Cryptosporidium and Giardia in natural, drinking and recreational water of Northwestern Greece"Acta Hydrochimica et Hydroblologica. (in press). (2002)
• [Publications] Karanis, P., Kimura, A.: "Evaluation of flocculation method for the purification of Cryptosporidium parvum oocysts from water samples"Letters in Applied Micrrobiology. (in press). (2002)