DNAメチル化の修飾多型性の検出とその法医学領域への応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670403
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 中屋敷 徳 岩手医科大学, 医学部, 講師 (10146029)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金武 潤 岩手医科大学, 医学部, 助手 (90326661) ; 熊谷 礼子 岩手医科大学, 医学部, 助手 (30118294)
• Keywords: 多型現象 / ゲノムインプリンティング / DNAメチル化 / 法医学

Research Abstract

1 ヒト末梢血ゲノムDNAにおいて、第11染色体インプリンティング領域(11p15.5)内の隣り合う、IGF2ならびにH19遺伝子における塩基置換の検出を種々の方法で検討し、サンプル数を増やして、岩手県人集団の遺伝子頻度を求めた。H19遺伝子の1塩基置換はPCR-RFLP法、その上流に近接する3塩基置換ならびにIGF2の1塩基置換はPCR-SSCP法で検出した。IGF2の塩基置換部位の下流に存在する連続する2つのCAリピートSTRについては検出が難しく、方法を検討中である。ゲノムDNAにおける各型の遺伝性については調べた限りにおいて矛盾は見られていない。
末梢血RNAについて、IGF2のmRNAの2段階PCRにより目的領域を増幅し、その発現状況を調べている。上記IGF2多型をヘテロに持つサンプルにおけるLOH(Loss of heterogeneity)の存在については現在検討中である。
2 ゲノムDNAのメチル化シトシンの有無はbisulfite処理後の、MSP(methylation specific PCR)法で調べた。この方法において、プライマーおよびDNAポリメラーゼの選択が非常に重要であった。現在、IGF2(1塩基置換)およびH19(3塩基置換)領域について、MSP法による安定したDNA断片の増幅が可能となった。メチル化多型の定性的検出はbisulfite処理後のPCR-RFLP法で行い、サンプル間にメチル化シトシンの存在に伴うであろう差異が観察され、シーケンシングで確認する予定である。メチル化の程度(ゲノムDNAの部分的メチル化)についても、今後、定量的検出法で試みたい。