エタノールによるミトコンドリアの融合と巨大化-培養心筋細胞を用いた数量的解析-

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670408
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 真下 啓子 日本医科大学, 医学部, 助手 (90113000)
• Keywords: 培養心筋細胞 / エタノール / ミトコンドリア / 巨大化 / 生体蛍光染色 / flow cytometry / ミトコンドリア膜電位

Research Abstract

「エタノールによるミトコンドリアの融合・巨大化は、呼吸能の低下を代償する機構である」という仮説を検証するとともに、その融合・巨大化のメカニズムの解明を目的とする。
心筋細胞のミトコンドリアの大きさや膜電位(△Ψ_m)などに対するエタノールの影響を検討するために、培養心室筋細胞を0,50,200mMのエタノール培養液に曝露し、1,3,6,24時間後に、ミトコンドリアを特異的に生体蛍光染色する蛍光色素(JC-1(赤色光と緑色光の比が△Ψ_mを反映); MitoTracker【○!R】Green FM(MTG ;大きさに比例) ; DiOC_6(3)(大きさに比例); dihydrorhodamine123(DHR ; reactive oxygen species(ROS)の発生量))で染色し、以下の方法でその変化を計測した。
1.【生きた細胞のミトコンドリアの蛍光顕微鏡観察】(1)現在進行中であり、来年度にまとめて報告する。
2.【flow cytometryによるミトコンドリアの巨大化の数値化】
(2)200mMエタノール曝露1時間では、JC-1の緑色と赤色蛍光が0mM曝露に比べて減少したが、MTGやDiOC_6(3)の蛍光は少し増加し、DHRの蛍光は変化がなかった。3時間では、JC-1の緑色光は減少したままだが赤色光は増加し始め、DHRの蛍光も増加し始めた。6時間では、JC-1の緑色光は回復して赤色光は増加した。24時間では、JC-1の緑色光が増加して赤色光が著増し、MTGやDiOC_6(3)、DHRの蛍光はいずれも時間経過につれ増加した。50mMエタノールではこれらの変化は小さかった。
(3)心筋細胞のミトコンドリア分画をMTGで染色したところ、個々の単離ミトコンドリアの蛍光強度は、200mMエタノールにより、(2)と同様に時間経過とともに増加した。
以上のことから、200mMエタノールに曝露した心筋細胞のミトコンドリアは、1時間後に△Ψ_mが脱分極側にシフトしたことから、この時点では呼吸機能が低下したと考えられるが、この時既に少し大きくなり始めており、時間経過とともにさらに大きくなった。△Ψ_mは3時間後に逆に過分極し始めて、時間経過につれて過分極が強まるとともに、ROSが増加していった。即ち、ミトコンドリアのエタノール曝露直後の呼吸機能抑制は、その経時的な巨大化とともに回復したが、ROS発生の増加を伴った。

Research Products

• [Publications] Mashimo, K., Sato, S., Ohno, Y.: "Acute cytotoxic effects of ethanol on cultured mouse myocardial cells in a monolayer-Enzymatic, chronotropic and ultrastructural studies-"Jpn. J. Alcohol Studies & Drug Dependence. 36(2). 142-153 (2001)
• [Publications] 真下啓子, 佐藤茂, 大野曜吉: "慢性エタノール曝露培養心室筋細胞の拍動数とミトコンドリアの増大"Jpn. J. Alcohol Studies & Drug Dependence. 36(4). 322-323 (2001)