ラット新規セリンプロテアーゼの分子生物学的検討および膵疾患マーカーとしての意義

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670508
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 片岡 慶正 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (70185792)
• Keywords: chymoapsin / serine protease / 膵消化酵素 / リコンビナント蛋白 / 基質特異性 / ELISA

Research Abstract

我々はラット膵におけるセリンプロテアーゼをクローニングし、これをChymopasinと命名した。リコンビナント蛋白はp TrcHisベクターを用いて、大腸菌の系でFusion蛋白として作成した。Fusion蛋白はChymopasin活性化体にHistidine Tag及びEnterokinase認識部位を付加している。Histidine Tagによりリコンビナント蛋白の精製は容易となり、またEnterokinaseを作用させることによりリコンビナント蛋白を活性化させることができる。リコンビナント蛋白はInclusion bodyとして不溶化した状態で産生されたが、Ureaを用いて可溶化し、Affinity Chromatographyにて精製した。Enterokinase処理をしたこのリコンビナント蛋白は酵素活性を有していた。検索した範囲ではセリンプロテアーゼの各種基質のうち、キモトリプシンの基質であるSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA、Glt-Ala-Ala-Phe-MCA、Benzoyl-Tyrosil-pNAに対してのみ活性を持っていた。
ペプチド抗体を2種類作成し、これを用いてELISAの系の作成を試みた。抗体1を96穴プレートに吸着させ、リコンビナント蛋白を添加、さらにビオチン化した抗体2、続いてストレプトアビジンHRPを結合させ、ABTSを発色基質とし、405nmでO.D. を測定した。同方法では、現在約10μg/mlが測定の限界である。
一般に測定されている膵蛋白分解酵素Trypsin、Elastase1は、いずれも正常値がng/mlオーダーであり、またChymotrypsinも同様である。すなわちtrypsinはRIA法にて101-408ng/ml、elastase1はRIA法にて100-410ng/dl、EIA法にて2.9-19.2ng/ml、chymotrypsinはRIA法にて37.5±19.6ng/mlである。またキモトリプシンの急性膵炎時の値は449±19.6ng/mlと報告されている。chymopasinの血清レベルは不明であるが、ng/mlレベルの測定を行うため、さらに感度を上げる必要があると考えられる。
血清を検体として上記方法によりChymopasinが測定可能かどうか、濃縮血清を用いPreliminaryに検討したが検出不可能であった。血清中のChymopasinはSerpinと複合体を形成している予想され、そのため今回作成したペプチド抗体との結合が出来ない可能性がある。現在あらたな抗体作成を含め検討中である。

Research Products

• [Publications] Sogame Y, Kataoka K, Kato M, Sakagami J, Osawa S, Takatera A, Mitsuyoshi M, Usui N, Mitsui S, Yamaguchi N.: "Molecular cloning and characterization of chymopasin, a novel serine protease from rat pancreas"Pancreas. 25・4. 378-386 (2002)
• [Publications] Takaoka K, Kataoka K, Sakagami J.: "The effect of steroid pulse therapy on the development of acute pancreatitis induced by closed duodenal loop in rats"J Gastroenterol. 37・7. 537-542 (2002)
• [Publications] Sakagami J, Kataoka K, Sogame Y, Usui N, Mitsuyoshi M.: "Ultrasonographic splanchnic arterial flow measurement in severe acute pancreatitis"Pancreas. 24・4. 357-364 (2002)
• [Publications] Osawa S, Kataoka K, Sakagami J, Sogame Y, Kawasaki C, Takaoka K, Yasuda H, Takatera A.: "Relation between morphologic changes in the main pancreatic duct and exocrine pancreatic function after a secretin test"Pancreas. 25・1. 12-19 (2002)