プロトンポンプβサブユニット結合蛋白の同定による胃酸分泌機構の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670521
• Research Institution: Tokyo Woman's Medical University
• Principal Investigator: 斉藤 寿仁 東京女子医科大学, 医学部・内科, 講師 (50246609)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福嶋 康之 東京大学, 医学部・内科, 医員 ; 高橋 春樹 東京女子医科大学, 医学部・内科, 助手 (00246612) ; 大塚 洋子 東京女子医科大学, 医学部・内科, 助手 (20307606)
• Keywords: プロトンポンプ / GST融合蛋白質 / 胃酸分泌

Research Abstract

プロトンポンプH^+K^+ATPaseはα、βサブユニットからなる2量体でありβサブユニットはプロトンポンプの細胞内局在を決定する役割を果たすと考えられている。βサブユニットのN末端から30数アミノ酸までの細胞内に存在する部分に結合する未知蛋白質の同定を目的として、N末端から30数アミノ酸部分に対応するペプチドを合成した。合成した蛋白をアフィゲルビーズに付着させてカラムを作成した。カラムにラット胃粘膜ライセートをアプライし、付着したライセート中の蛋白を溶出し電気泳動で同定した。泳動で得たゲルのバンドを切り出して蛋白のペプチドシークエンスを行いアミノ酸配列を同定した。λgt11でラットの胃粘膜cDNAライブラリーを作製し、アイソトープでリン酸化したβサブユニットの細胞内部分を含むGST融合蛋白をプローブとして発現クローニングを行った。泳動で同定された蛋白質の機能を解析するため、抗体による免疫染色、免疫沈降法などを用いて壁細胞での局在を検討した。胃酸分泌のための刺激の無い状態での休止期のプロトンポンプを細胞内に固定する機構、刺激時にその固定を解除するメカニズムに関与する蛋白質を胃粘膜ライセートから同定することが可能となった。現在使用されているプロトンポンプ阻害薬剤数種類について休止状態のプロトンポンプに対する感受性に着目した報告もあり、本研究の手法を用いることによりβサブユニットとの相互作用を有する蛋白質の機能の解析がさらに進むと思われる。

Research Products

• [Publications] Otsuka H. et al.: "Long-lasting binding of IT-066 to human histamine H_2 receptor"Digestive Diseases & Sciences. 45. 796-801 (2000)
• [Publications] Fukushima Y. et al.: "Palmitoylation of the canine histamine H_2 receptor occurs at Cys(305) and is important"Biochimica et Biophysica Acta. 1539. 181-191 (2001)
• [Publications] Fukushima Y. et al.: "G649, an alleic variant of the human H_2 receptor with low basal"The Pharmacogenomics Journal. 1. 78-83 (2001)
• [Publications] Fukushima Y. et al.: "Potent and long action of lafutidine on the human histamine"Digestion. 64. 155-160 (2001)
• [Publications] Saitoh T. et al.: "Effects of N-alpha-methyl-histamine on human H_2 receptors"Gut. (in press).
• [Publications] Saitoh T.: "Intragastric acidity and circadian rhythm"Biomed. Pharmacothr. 55. 138-141 (2001)