2000 Fiscal Year Annual Research Report
C型肝炎ウイルスのコアタンパク質の選択的RNA結合と生理学的意義
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12670527
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
伊達 孝保 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50019676)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松井 理 金沢医科大学, 医学部, 助手 (60288272)
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| Keywords | C型肝炎ウイルス(HCV) / コアタンパク質 / RNA結合 / ゲルシフトアッセイ(EMSA) / 酵母three-hybrid system / HCVゲノム / RNA / RNAライブラリー |
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| Research Abstract |
HCVゲノムの上に存在するコアタンパク質の高親和性領域を決めるため,ゲルシフトアッセイ(EMSA)によるスクリーニングを行った.用いたコアタンパク質はRNA結合領域をもつ1〜90アミノ酸である.コアタンパク質が二本鎖RNA(dsRNA)に強く結合する性質を利用し,アイソトープ標識したdsRNAと競合するRNAを探した.ゲノムを断片化し,試験管内でRNAを合成して調べたところ,5'-非翻訳領域(5'-NCR),コアタンパク質codingの5'端領域,および3'-NCRの3'末端のヘアピン領域に強く親和性を示す領域があった.コアcodingの5'端領域と3'-NCRの領域に関しては,30bほどに限局できたが,5'-NCRについては最低2ヶ所以上存在することがわかったものの,その場所について決めることはできなかった.
上記の方法は,かなりの労力を要するため,酵母を用いたthree-hybrid systemによる親和性領域のクローニングを試みた.しかし,既報の条件ではベクターだけでも陽性クローンがでるため,3-アミノトリアゾール濃度10mMにしてバックを下げた.HCV-1b全ゲノムを断片化したライブラリーを作成し,陽性クローンを得,それからcDNAを回収して塩基配列を決定した.得られた30個のクローンの解析結果をみると,高親和性領域はHCVゲノム全領域に散在していた.現在,EMSAにより高親和性領域との関連性を調べている.
宿主細胞中に含まれるコアタンパク質に対する高親和性RNAの検索については,three-hybrid systemの有効性を検討をお行ないながら,一方コア発現細胞樹立に時間を費やしている.
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