アルツハイマー病脳に沈着するアミロイドβ蛋白のN末端切断酵素(BACE)の解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670590
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 玉岡 晃 筑波大学, 臨床医学系, 助教授 (50192183)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 望月 昭英 筑波大学, 臨床医学系, 講師 (40301080)
• Keywords: アルツハイマー病 / アミロイドβ蛋白 / BACE-1 / APP

Research Abstract

本年度は前年度までに作成したウサギ抗ヒトBACE-1抗体の特異性をウエスタンブロット法にて検証し、ヒト脳の連続抽出画分におけるBACE-1の同定と定量、およびヒト脳の各部位におけるBACE-1の免疫染色性を明らかにすることを目的とした。方法:BACE-1の全長DNAをヒト脳ライブラリーからクローニングし、pcDNA3に挿入し、pcDNA3-hBACE-1を作成した。次にこのコンストラクトをHeLa細胞に一過性に強制発現させ、細胞回収後その膜画分を抽出し、これをヒトBACE-1のポジティブコントロールとした。昨年度、抗pre-BACE抗体(BACE-1の22〜33を認識),抗BACE-N(BACE-1の46〜56を認識),抗BACE-C(BACE-1の485〜501を認識)のポリクローナル抗体を作成したが、抗体の特異性を検証するために、さらに感度、特異度がわかっている既製の抗HB1-1#2抗体(47-80),1131抗体(46-59),1133抗体(487-501)を用いて比較検討した。対象試料としてはアルツハイマー病(AD)、ヒト対照凍結脳海馬を用いた。各サンプルは3倍容量のbufferにてホモジェナイズしたのち10万Xgにて遠心後に上清を分離し、タンパク分解酵素阻害剤を加えたTSE,1%Triton-X/TSE,05%SDS/TSEにて連続抽出を行なった。各サンプルは蛋白量を一致させ、各種抗体(抗BACE-1抗体、抗GFAP抗体、抗MAP-2抗体)によるウエスタンブロットを同時に行ない、目的蛋白をdensitometerで定量し、神経細胞あたりのBACE-1量(BACE-1/MAP-2)を計算した。また、免疫組織化学的にヒト脳薄切切片を各抗BACE-1抗体を用いてDAB法にて染色した。結果:抗BACE-N抗体、抗BACE-C抗体はhBACE-1を同定でき、感度は既製抗体より優れていた。hBACE-1は1%Triton-X/TSE画分を中心に回収された。さらに様々な抗体による染色パターンの解析からtruncated formおよびmature formの存在が推定された。抗preBACE-1抗体では、全長のpre-BACE-1が同定されなかったことから、preBACE-1は細胞内で合成後に速やかに切断されBACE-1になると予想された。また、BACE-1/MAP-2は正常対照群と比較してAD群にて増加傾向が認められた。ヒト脳の免疫組織染色では神経細胞体が染色され、グリアの染色性は弱かった。今後さらに抗MAP-2抗体や抗GEAP抗体による2重染色により、BACE-1発現細胞を明らかにしていく予定である。

Research Products

• [Publications] 玉岡 晃: "重症筋無力症に伴った筋萎縮と運動ニューロン疾患との鑑別が困難であった症例"こころの臨床 a・la・carte. 22(増刊号). 98-100 (2003)
• [Publications] Ishii K: "Chrysamine G and its derevative reduce amyloid beta induced neurofoxicity in mice"Neurosci lett. 333・1. 5-8 (2002)
• [Publications] Watanabe M: "Cortico steroid-responsive asymmetric neuropathy with a myelin protein gene mutation"Neurology. 59・5. 767-769 (2002)
• [Publications] 吉田秀明: "Clavicle brace (鎖骨固定バンド)が運動及び呼吸機能の改善に有効であった筋萎縮性側索硬化症の一例"運動障害. 12・1. 37-41 (2002)
• [Publications] Matsuno S: "Enhanced magnetic resonance angiography of a spinal dural arteriovenous fistula"Arch Neurol. 59・7. 1185 (2002)
• [Publications] 吉田秀明: "10数年の経過により著名な筋膜肥厚と自律神経障害を呈し、ステロイドが奏功したdiffuse fascitis with eosinophilia"運動障害. 12・1. 43-47 (2002)
• [Publications] 玉岡 晃: "アルツハイマー病の抗体療法"現代医療. 34・1. 237-244 (2002)
• [Publications] 玉岡 晃: "痴呆症になり易いひとはいますか、一般的な気質や遺伝的にはどうですか"CLINICIAN. 506・48. 40-43 (2001)
• [Publications] 玉岡 晃: "痴呆症 早期発見と対処法"わくわくライフいばらき. 63. 16-17 (2001)
• [Publications] 玉岡 晃: "パーキンソン病と痴呆性疾患の最近の話題をめぐって〜臨床的側面を中心に〜"真壁郡市医師会報. 105. 8-9 (2001)
• [Publications] 玉岡 晃: "上肢のしびれの鑑別診断"Medical Practice. 18. 1032 (2001)
• [Publications] 玉岡 晃: "アポE isoformと脳内過酸化脂質"Dementia Japan. 15・1. 47-55 (2001)
• [Publications] Harada H: "Clinical improvement following interferon-alpha alone as an initial treatment in chronic"Muscle Nerve. 23・2. 295-296 (2000)
• [Publications] 玉岡 晃: "痴呆症状"CLINICAL NEVROSCIENCE. (発表予定).
• [Publications] 玉岡 晃: "脳脊髄への転移"Modern Physician. (発表予定).
• [Publications] 玉岡 晃: "知の螺旋"茨城県医師会報. 589・1. 47-48 (2003)
• [Publications] 松下正明: "痴呆における精神症状のコントロール"Cognition and Dementia. 1・1. 75-83 (2002)
• [Publications] 玉岡 晃: "アルツハイマー病治療薬"医薬ジャーナル・新薬展望2002. 38・S1. 119-126 (2002)
• [Publications] Tokuda T: "Plasma levels of amyloid β proteins did not differ between subjects with and without taking"Ann Neurol. 49・4. 546-547 (2001)
• [Publications] Hoshi K: "Cessation of cerebral hemorrhange recurrence associated with corticosteroid treatment in"Amyloid. 7・4. 284-288 (2000)
• [Publications] Cavani S: "Plasma levels of amyloid β 40 and 42 are independent from ApoE genotype and mental"Am J Med Genet. 95・3. 224-228 (2000)
• [Publications] 古庄健太郎: "AIDS脳症にみられた脳トキソプラズマ症"神経内科. 53・Suppl.2. 398-399 (2000)
• [Publications] 河野 豊: "Diffusion-weighed MRIが有用だった小脳橋角部の類表皮嚢胞"神経内科. 53・Suppl.2. 414-415 (2000)
• [Publications] 渡辺雅彦: "橋梗塞で発症した多発椎骨動脈瘤"神経内科. 53・Suppl.2. 286-287 (2000)
• [Publications] Tamaola A: "Encreased amyloid β protein in the skin of patients with amyotrophic lateral sclerosir"J Neurol. 247・8. 633-635 (2000)
• [Publications] 星野幸子: "MRIで脊髄神経節・神経根にgadolinium造影効果を伴う腫大を認めた慢性炎症性脱髄性"茨城県画像診断研究会誌(Imaging). 11. 30-33 (2000)
• [Publications] 河野 豊: "成人期に発症した睡眠時の律動性運動障害(rhythmic movement disorder of sleep)の一例"運動障害. 10・1. 25-29 (2000)
• [Publications] Tamaoka A: "Apolipoprotein E allele-dependent antioxidant activity in brains with Alzheimer's disease"Neurology. 54・12. 2319-2321 (2000)
• [Publications] Yasuda M: "Novel presenilin-l mutation with widespread cortical amyloid deposition but limited cerebral amyloid"J Neurol Neurosurg Psychiatry. 68・2. 220-223 (2000)
• [Publications] Mochizuki A: "Aβ42-positive non-pyramidal neurons around amyloid plaques in Alzheimer's disease"Lancet. 355・9197. 42-43 (2000)
• [Publications] Ishii K: "A case of primary focal lingual dystonia induced by speaking"Eur J Neurol. 8・5. 507 (2001)
• [Publications] 星野幸子: "胸腺腫合併重症筋無力症の治療経過における抗titin抗体ELISAの推移"神経治療学. 18・2. 177-183 (2001)
• [Publications] 河野 豊: "緩徐に進行する運動ニューロン疾患様症状を呈した成人型Sandhoff病の1例"臨床神経. 41・1. 36-39 (2001)
• [Publications] 河野 豊: "胸腺腫を伴ったIsaacs病の1例"運動障害. 11・2. 85-95 (2001)
• [Publications] Ishii K: "Distinguishable effects of presenilin-1 and APP717 mutations on amyloid plaque deposition"Neurobiol Aging. 22・3. 367-376 (2001)
• [Publications] Matsuno S: "A case with myasthenia gravis (MG) emerging after splenectomy for idiopathic thrombocytopenic"J Med. 31・5-6. 327-332 (2001)
• [Publications] 古庄 健太郎: "Bowen病を合併した神経周膜炎の1例"臨床神経. 42・6. 527-529 (2002)
• [Publications] 藤田祐之: "一過性脳虚血発作にてlimb shakingを繰り返した内頚動脈閉塞症の1例"日本内科学会誌. 91・5. 229-231 (2002)
• [Publications] Tokuda T: "Moderate or high doses of prednisolone (30-60mg/day) for diseases other than AD decreases amyloid"Neurology. 58・9. 1415-1418 (2002)
• [Publications] Fujita Y: "Fungal endophthalmitis and Churg-Strauss Syndrome"Intern Med. 41・2. 167 (2002)
• [Publications] Miyawaki K: "Three-dimentional and fractal analyses of assemblies of amyloid β protein subtypes (Aβ40 and Aβ42(43))"Acta Neuropathol (Berl). 103・3. 228-236 (2002)
• [Publications] 原田 祐嗣: "好酸球関連抗体にて好酸球の筋浸潤と脱顆粒所見を確認した好酸球性筋炎の1例"臨床神経. 41・7. 387-389 (2001)
• [Publications] 玉岡 晃: "アルツハイマー病"スズケンメディカル. 4・2. 4-6 (2001)
• [Publications] 玉岡 晃: "アルツハイマー病"スズケンファーマ. 4・2. 6 (2001)
• [Publications] 玉岡 晃: "脳出血と髄液中のcystatin C"臨床検査. 44・13. 1668-1670 (2000)
• [Publications] 玉岡 晃: "ApoEの抗酸化作用からみたAlzheimer病の発症誘導機構"最新医学. 55・7. 95-103 (2000)
• [Publications] 玉岡 晃: "髄液・血液検査"脳の科学(2000年臨時増刊号). 22・245. 185-189 (2000)
• [Publications] 玉岡 晃: "神経内科学書"豊倉康夫編, 朝倉書店(発表予定).
• [Publications] 玉岡 晃: "新体系看護学"紫芝良昌, 黒岩義之編, メヂカルフレンド社. 12 (2003)
• [Publications] 玉岡 晃: "今日の治療指針(第5版)"亀山正邦, 高久史麿編, 医学書院. 3 (2002)
• [Publications] 玉岡 晃: "難病の指針(第4版)"茨城県医師会難病の指針編集委員会(発行人佐藤怜). 7 (2002)
• [Publications] 玉岡 晃: "Annual Review神経2001"柳澤信夫, 篠原幸人, 岩田誠, 清水輝男, 寺本明編, 中外医学社. 14 (2001)
• [Publications] 玉岡 晃: "臨床医学のMinimum Essential"三井利夫, 草刈潤監修, 大塚藤男編集, 金原出版株式会社. 17 (2000)
• [Publications] 玉岡 晃: "検査値のみかた(改訂2版)"中井利昭編, 中外医学社. 19 (2000)