HAM患者の脳脊髄液細胞中のプロウイルスと転写産物の同時かつ定量的検出法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670613
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 森豊 隆志 鹿児島大学, 医学部, 助手 (90305110)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 反町 勝 鹿児島大学, 医学部, 教授 (70036440) ; 納 光弘 鹿児島大学, 医学部, 教授 (10041435)
• Keywords: HTLV-I / HAM / 脳脊髄液細胞 / in situ hybridization法 / 免疫組織学的方法 / レーザスキャニングサイトメータ

Research Abstract

1.HTLV-Iプロウイルスと転写産物の同時かつ定量的検出法の基本的測定方法の確立のため、以下を実施した。
(1)HTLV-IプロウイルスDNA、mRNA、蛋白の蛍光による検出系の確立。
我々が、開発したHTLV-ImRNAと抗原の高感度検出法に加え、今回新たに開発した高感度のプローブを用いたFISH法によりHTLV-IプロウイルスDNAをsingle copyレベルで可視化することに成功した。
(2)(1)の蛍光物質のレーザスキャニングサイトメータ(LSC)での定量条件の検討。
DNA、mRNA、蛋白の各々一細胞当たりの蛍光量を測定し、相対的な蛍光強度の比較を行ったが、LSCの検出感度が十分でなく、その感度を上昇させる工夫が必要であることが判明した。
(3)HTLV-IプロウイルスDNAとウイルスmRNAまたは蛋白の同時検出のための条件の検討。
各々を単独に実施する場合には、それぞれに至適な異なる固定方法等で実施していたが、同時検出の際に至適となる共有できる条件の検討を行い、最適な固定方法を新たに見出した。
(4)LSCでの蛍光2色同時検出のための条件の検討。
LSCでの定量を実施する際に、同時染色を施す場合に用いる蛍光色素の組み合わせとして最適の組み合わせを検討した。蛍光2色検出において互いの蛍光の輝度および波長のバランスを検討し、いわゆるかぶりの影響等を検討した所、LSCの現状で持つ機能では不十分ではあるものの2色のデータを融合する機能を用いることが有用であることが判明した。
2.次年度に計画しているHAM患者の脳脊髄液細胞中のHTLV-Iプロウイルスと転写産物の関係の解析のために用いる多数の患者の脳脊髄液細胞サンプルの収集、ストックの具体的方法の検討を行った。

Research Products

• [Publications] Moe Moe Aye: "Histopathological analysis of four autopsy cases of HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis : inflammatory changes occur simultaneously in the entire central nervous system."Acta Neuropathol.Berl.. 100. 245-252 (2000)
• [Publications] Toshio Matsuzaki: "HTLV-I-associated myelopathy (HAM)/tropical spastic paraparesis (TSP) with amyotrophic lateral sclerosis-like manifestations."J.Neurovirol. 6. 544-548 (2000)