TGF-βmRNAに対するリボザイムによる血管増殖性疾患の遺伝子治療の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670699
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 福田 昇 日本大学, 医学部, 助手 (40267050)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡辺 吉康 日本大学, 医学部, 助手 (10267049)
• Keywords: リボザイム / TGF-β / 血管平滑筋細胞 / 増殖 / RT-PCR / ウエスタンブロット / キメラ

Research Abstract

1.TGF-βmRNAに対するリボザイムの分子設計、合成、RNA切断実験
1)ヒトおよびラットTGF-βmRNAの二次構造のコンピュータ解析よりGUC配列を含むループ構造をターゲットサイトとし、ハンマーヘッド型リボザイムをデザインした。コントロールとして1塩基異なるミスマッチリボザイムを設定した。
2)T7ポリメラーゼを用いて鋳型DNAをRNAにした。
3)切断実験としてターゲットRNAを上記と同様に合成し、MgCl2存在下でインキュベートしシーケンスゲルで切断産物を確認した。
4)これら結果を基に核酸分解酵素に対し耐性を得るため部分的にDNA配列を持つDNA/RNAキメラ型とてRNAシンセサイザーで合成した。
2.血管平滑筋細胞(血管平滑筋細胞(VSMC)増殖に対する作用の検討に対する作用の検討
上記ヒトおよびラットTGF-βmRNAに対するDNA/RNAキメラ型リボザイムをlipofectinを用いヒトまたは高血圧自然発症ラット(SHR)由来VSMCにデリバーした。細胞増殖としてDNA生合成、アンジオテンシII刺激による細胞数の増加を測定し、VSMC増殖に対し強力な抑制作用を確認した。
3.TGF-β発現に対する作用
ヒトおよびラットTGF-βmRNAに対するDNA/RNAキメラ型リボザイムをlipofectinを用いヒトまたはSHR由来VSMCでRT-PCR法によるTGF-βmRNA発現、ウエスタンブロット法によるTGF-β蛋白発現の有意な低下を確認した。
これら二つのリボザイムの塩基配列は日本大学国際ビジネス育成センター(Nubic)を通して、特許を取得した。
またヒトmRNAに対するリボザイムはBiochem Biophys Res Communに、ラットTGF-βmRNAに対するリボザイムはCardiovasc Resに掲載した。

Research Products

• [Publications] Fukuda N,Hu W-Y et al.: "Angiotensin II upregulates transforming growth factor-β type I receptors on rat vascular smooth muscle cells."Am J Hypertens. 13. 191-198 (2000)
• [Publications] Kishioka H,Fukuda N et al.: "Effect of methylene methylimino-linkaged antisense oliigonucleotide to PDGF A-chain on growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats."Eur J Pharmacol. 392. 129-132 (2000)
• [Publications] Hu W-Y,Fukuda N,Kanmatsuse K: "Phenotypic modulation by fibronectin enhances the angiotensin II-generating system in cultured vascular smooth muscle cells."Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20. 1500-1505 (2000)
• [Publications] Kubo A,Fukuda N et al.: "Endogenous angiotensin II regulates the cell cycle of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats."Am J Hypertens. 13. 1117-1124 (2000)
• [Publications] Teng J,Fukuda N et al.: "DNA-RNA chimeric hammerhead ribozyme to transforming growth factor-β1 mRNA inhibits the exaggerated growth of vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats."Cardiovasc Res. 48. 138-147 (2000)
• [Publications] Su J,Fukuda N,Hu W-Y,Kanmatsuse K.: "Ribozyme to Human TGF-β1 mRNA Inhibits the Proliferation of Human Vascular Smooth Muscle Cells."Biochem Biophys Res Commun. 19. 401-407 (2000)
• [Publications] Hu W-Y,Fukuda N, et al.: "Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation by DNA/RNA chimeric hammerhead ribozyme targetting to rat platelet-derived growth factor A-chain mRNA"J Hypertens. 19. 203-212 (2001)