アデノウィルスベクター重複感染によるメラノーマ遺伝子治療の研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12670824
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 村上 信司 愛媛大学, 医学部・附属病院, 講師 (50175626)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 花川 靖 愛媛大学, 医学部, 助手 (90284398) ; 白方 裕司 愛媛大学, 医学部, 助手 (50226320)
• Keywords: メラノーマ / ASK1 / adenovirus vector / apoptosis / gene therapy

Research Abstract

平成12年度はアデノウィルスベクターの作製とメラノーマ細胞の調整・増殖について検討した。アデノウィルスベクターの作製:constitutive active formのASK1,IL-2cDNAをプラスミドに導入し、E.coliにtransfectさせ大量に培養・精製した。これをコスミドカセットに組み込み、Eco T221制限酵素にてE1部を切断したアデノウィルスベクターDNA-TPCとともに293細胞にco-transfectした。数日間培養し、homologous recombinationにより、ASK1,IL-2が組み込まれたアデノウィルスベクターを作成・分離した。これらのアデノウィルスベクターを293細胞に感染させ、大量培養を行い、293細胞を回収し、超音波処理にて破砕後、塩化セシウム密度勾配法にてウィルスを精製、濃縮を行った上で、PBSに透析した。このようにして得られたウィルス液は力価検定を行い、分注後超低温槽にて保在した。メラノーマ細胞の調整:12種類のメラノーマ細胞を10%牛胎児血清添加DMEM,ないしは RPMI1640培地にて培養した。それぞれ6well plateに播種し、5日間培養後、細胞数をコールターカウンターで測定した。細胞増殖能の高いものと低いもので2群に大別した。さらに、2種類の細胞を選択し、メラノーマ細胞にASK1アデノウィルスベクターを感染させ、細胞の形態変化を観察したところ、MOI=20でほとんどの細胞がアポトーシスを起こしていることが確認できた。