アデノ随伴ウイルスベクターを用いた血友病Aに対する遺伝子治療の基礎的検討

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671003
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 水上 浩明 自治医科大学, 医学部, 助手 (20311938)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 窓岩 清治 自治医科大学, 医学部, 講師 (70296119)
• Keywords: 血友病A / AAVベクター / 遺伝子治療 / 骨格筋 / 肝臓 / エリスロポエチン

Research Abstract

本年度は準備及び基礎的検討として、ベクター構築・発現の確認を行った。第VIII因子のcDNAを入手し、当初の計画に従って重鎖・軽鎖を発現するベクターを各々構築した。しかしながら本研究課題においては骨格筋及び肝臓を標的臓器にすることから各々に最適なプロモーターを選ぶ必要があり、最初にこの点の検討を行った。すなわち、肝臓特異的なプロモーターとしてEF-1及びPGKを、骨格筋に特異的なものとしてCKを,また特定の臓器を対象としないCAG及びCMVプロモーターを用いてプロモーター活性の比較を行った。検出系としては測定が容易なエリスロポエチン遺伝子を用い、同じバックボーンを用いてこれらのプロモーターを挿入したAAVベクターの作製を行った。今後はこれらのベクターを動物個体に投与し、各臓器別に発現の良好なプロモーターを選び出す。この結果を第VIII因子の重鎖・軽鎖を発現するベクターに反映させ、動物個体レベルにおける治療効果の検討を行う。一方、AAVには6つの血清型が知られているが、これまで主に検討がなされたAAV-2以外の血清型を用いてベクターを作製することで遺伝子発現効率が大きく異なる可能性が報告されつつあることから、他の血清型のウイルスベクター作製システムについても入手し、LacZ遺伝子などをマーカーとするベクターを各々作製し発現効率の違いを検討している。よってプロモーター及びキャプシドの違いの2つの次元から第VIII因子の発現を検討することになる。また、動物個体における検討においてはCTL及び抗体産生の有無などの点からも評価を行い、本治療法の実用化に向けた基礎データの蓄積にもつとめる予定である。

Research Products

• [Publications] Handa A,Muramatsu S,Qiu J,Mizukami H,and Brown KE: "Adeno-associated virus (AAV)-3-based vectors transduce haematopoietic cells not susceptible to transduction with AAV-2-based vector"Journal of General Virology. 81. 2077-84 (2000)
• [Publications] Shen Y,Muramatsu SI,Ikeguchi K,Fujimoto KI,Fan DS,Ogawa M,Mizukami H, et.al.: "Triple transduction with adeno-associated virus vectors expressing tyrosine hydroxylase, aromatic-L-amino-acid decarboxylase, and GTP cyclohydrolase I for gene therapy of Parkinson's disease."Human Gene Therapy. 11. 1509-19 (2000)
• [Publications] Kanazawa T,Urabe M,Mizukami H,Okada T,Kume A,Nishino H,McClelland A, et.al.: "Gammma rays enhance rAAV-mediated transgene expression and cytocidal effect of AAV-HSVtk/gancyclovir on cancer cells"Cancer Gene Therapy. (in press). (2001)
• [Publications] Kogure K,Urabe M,Mizukami H,Kume A,Sato Y,Monahan J,and Ozawa K: "Targeted Intergration of Foreign DNA into a Defined Locus on Chromosome 19 in K562 Cells Using AAV-Derived Components"International Journal of Hematology. (in press). (2001)
• [Publications] Ozawa K,Muramatsu S,Ikeguchi K,Fujimoto K,Shen Y,Fan DS,Mizukami H, et al.: "Progress in Gene Therapy-basic and clinical frontiers"VSP. 18 (2000)
• [Publications] Okada T,Shimazaki K,Nomoto T,Mizukami H,Urabe M,Monahan J,Ozawa K and Kawai N: "Methods in Enzymology"Academic Press (in press).