腎細胞の形質変換に関わる転写因子の同定と形質変換制御による腎炎治療の可能性

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671037
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 守山 敏樹 大阪大学, 健康体育部, 講師 (30283815)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安東 明夫 大阪大学, 健康体育部, 教授 (00028656) ; 三輪 岳志 大阪大学, 遺伝情報実験施設, 助教授 (20174229) ; 今井 圓裕 大阪大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (00223305)
• Keywords: 形質変換 / myofibroblast / 転写因子 / CArG配列 / SRF / one-hybrid system

Research Abstract

平滑筋αアクチン陽性のmyofibroblast出現は進行性腎障害の早期より認められる変化であり病変形成・進展過程に積極的に関与するものと考えられている。本研究ではmyofibroblast出現の分子機序を転写因子の面から明らかにし、その制御による進行性腎障害治療法の開発をめざしている。本年度は酵母のone-hybrid systemによる平滑筋αアクチン遺伝子イントロン1のCArG element(CArG#0)周辺に結合するDNA結合蛋白質のクローニングを実施した。まずCArG#0周辺の配列をプローベとしたgel shift assayにより同領域に少なくとも2種類の蛋白が結合することを明らかにした。そのうちの1つはc-fosのCArG配列により競合されること、またCArGへの結合蛋白質として知られるSerum Response Factor(SRF)に対する特異的抗体でsuper shiftすることからSRF-CArG複合体であることが明らかとなった。もう1つのバンドを形成する蛋白質がクローニングのターゲットとなるためプローベにポイントミューテーションを導入しターゲットとするバンドのみが得られる配列を作成した。この配列をDNA結合部位としたone-hybrid systemによってヒト胎盤および腎臓のライブラリーを素クリーニングしたところ少なくとも5種類のDNA結合蛋白質をコードするcDNAが単離された。現在そのうちの2つの転写因子について解析を進めている。1つの因子についてはgel shift assayで認められたもう1つのバンドを形成するものであることが明らかとなった。現在その転写制御機能を培養細胞を用いた系で解析中である。もう一つ解析中の転写因子についてはすでに平滑筋αアクチンのプロモーター活性を上昇させることを明らかにした。細胞から抽出した核蛋白質を用いたgel shiftでは今のところバンドが得られていないため、現在GST-転写因子融合蛋白質を作成し、よりpureな系でgel shift assayを行っているところである。