肝特異的トランスポーター遺伝子の発現調節機構の解明と肝疾患治療への応用

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671195
• Research Institution: TOHOKU UNIVERSITY
• Principal Investigator: 海野 倫明 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (70282043)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阿部 高明 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (80292209)
• Keywords: トランスポーター / 転写因子 / NF-E2 / ルシフェラーゼアッセイ / HT17 / AP-1 / 遺伝子上流域 / ケノデオキシコール酸

Research Abstract

申請者らは1999年肝細胞に特異的に発現している有機アニオントランスポータ、LST-1遺伝子を世界で初めて単離し発表した(J Biol.Chem.274:17159-63, 1999)。このLST-1遺伝子がコードしているLST-1蛋白質は、肝類洞側に存在し、肝細胞への胆汁酸、薬物、ホルモンなどの取込みに関与する極めて重要トランスポーターであることが明らかとなった。本研究では、ヒトLST-1遺伝子の発現調節機構を解明することを目的とする。平成12年度には以下が明らかとなった。
1.ヒトLST-1遺伝子5上流域をPCR法により単離することに成功し、約1600bpの配列を決定し、データーベースに登録した。
2.ヒトLST-1cDNAをプローブとして種々の培養細胞株のノーザンブロツトを施行した。LST-1を発現している細胞株は当科で樹立に成功した肝細胞癌由来細胞株HT17のみであった。
3.ヒトLST-1遺伝子5上流域を種々の長さに欠失させたdeletion mutantを作成し、これをルシフェラーゼリポータープラスミド(pGL3-Basic)に組み替えた。
4.これらリポータープラスミドをHT17細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入48時間後、細胞を溶解後、ルミノメーターによりルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、上流域約1050bpに存在する、AP-1/NF-E2結合領域が転写にもっとも重要であることを明らかにした。
5.このAP-1/NF-E2領域のoligomerを作成し、HT17細胞核抽出液を用いたゲルシフトアッセイ.を施行しこの領域に結合する転写因子が存在していることを明らかにした。
6.HT17細胞の培養液中にchenodeoxycholateを添加することによりルシフェラーゼ活性が低下することを明らかにした。