2000 Fiscal Year Annual Research Report
RT-PCR/HPLC法による末梢神経栄養因子の解析
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12671438
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
高山 真一郎 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (40138045)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
仲尾 保志 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (30188883)
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| Keywords | peripheral nerve / neurotrophic factor |
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| Research Abstract |
雌の5週齢ICRマウスを使用し、片側の坐骨神経切断モデルを作成した。切断後0、1、2、4週でマウスを屠殺し、切断側とその反対側(両側)の腓腹筋をそれぞれ採取(50mg前後)し内部標準dNGAを加え、AGPC法を用い、RNAを抽出した。組織中微量NGFmRNA定量法に基ずいて、得られたtotalRNAについてRT-PCRを行い、その反応生成物をHPLCで定量した。
【結果】pNG RNAおよびdNG RNAのRT-PCRは、各々のRNAの10〜30fgの添加量に比例してRT-PCR生成物を増加させた。また、一定量のdNG RNA(NGF:3fg/BDNF,NT-3:10fg)とpNG RNA(1〜30fg)を同時に加えRT-PCRを行ったところ、内部標準に対する比率は、加えたpNG RNA(1〜30fg)に対して直線関係が認められた。従って、mRNA量は内部標準に対するサンプルの割合と内部標準に対する標準RNAの割合を比較計算することができた。次に、マウス骨格筋のNGF、BDNF、NT-3mRNA量を定量した。その結果、コントロール群は各々、7.27±1.22、15.69±5.87、20.80±5.46fg/mgであった。坐骨神経切断後1週では切断側腓腹筋中NGF,BDNF,NT-3mRNA量は各々16.23、35.49、39.94fg/mg tissueとそれぞれ増加傾向にあった。反対側(健側)では7.73、18.63、21.75fg/mg tissueであった。切断後2週では28.43、102.86、50.57fg/mg tissueとさらに増加していた。反対側(健側)では5.99、25.39、22.94fg/mg tissueであった。
Deletion mutant RNAを内部標準として用いるRT-PCR法により、骨格筋中に含むまれる極微量な神経栄養因子mRNAの定量が可能となり、坐骨神経切断後1週、2週の腓腹筋では神経栄養因子mRNAは増加維持していた。
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