着床前初期胚における糖代謝酵素遺伝子の発現調節機構の解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671632
• Research Institution: Teikyo University
• Principal Investigator: 綾部 琢哉 帝京大学, 医学部, 助教授 (00272568)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 慎一朗 帝京大学, 医学部, 助手 ; 安藤 義将 帝京大学, 医学部, 助手
• Keywords: In situ PCR法 / in situ RT-PCR法

Research Abstract

In situ PCR法及びin situ RT-PCR法について、それぞれの方法論を確立した。
すなわち、本年度は、目標である卵での検討に先立ち、腫瘍組織での検討を通じて研究方法を確立した。新鮮で変性していない腫瘍組織を無菌的に採取し固定した。固定後、段階的に希釈したsucrose液に浸漬し、OCTコンパウンドに包埋した後、凍結した。Cryostatにて薄切し、buffer中に浸漬することにより、抗体の浸透性を高めた。切片の厚みにより浸漬する時間を調整した。浸透性が高すぎると、PCR産物が漏れ出してしまうため、至適化が困難であった。スライドグラスに切片をすくいとり、Perkin Elmer社のGeneAmp In Situ PCR System1000の封入システムあるいはTakara PCR Thermal Cycler MP用のスライドシールを用いて密封し、サイクリング反応を行なった。反応終了後、増幅されたDNAに特異的な蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、蛍光顕微鏡で観察した。
今後は、発育各段階ごとの胚を同時にサイクリング反応に供した後に解析し、蛍光強度を比較することにより、遺伝子発現の程度を半定量的に比較できる。同様にin situ RT-PCR法とin situ PCR法による成績とを組み合わせることにより、初期胚ゲノム由来の遺伝子発現とmaternal mRNA由来の遺伝子発現とを区別することができる。従来の方法で既に報告している細胞周期関連遺伝子の発現様式を標準として至適化が可能である。