眼創傷治癒におけるp130^<CAS>の果たす役割

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671707
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 大黒 伸行 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (00303967)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 篤志 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (20283773) ; 渡辺 仁 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (60252673) ; 井上 幸次 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (10213183)
• Keywords: p130^<CAS> / RGDSペプチド / 細胞接着 / 角膜上皮細 / 水晶体上皮細胞 / 網膜色素上皮細胞

Research Abstract

ヒト角膜cDNA libraryをスクリーニングし、ラットp130^<CAS>遺伝子と90%の相同性を有する遺伝子断片をクローニングした。続いて、RACE-PCR法を用いて5′側の残りの部分を同定し全長の遺伝子配列を決定した。この遺伝子は蛋白レベルでラットp130^<CAS>と80%以上の相同性があり、我々はこの蛋白をヒトp130^<CAS>と考えた。ついで、ノーザンブロット法にてヒト角膜上皮細胞とヒト角膜実質細胞にこの遺伝子が発現していること、および、その全長も同定したものとほぼ同じであることを確認した。
蛋白レベルでラットp130^<CAS>と、特にc末端においてほぼ100%の相同性を有していることから、すでに市販されているラットp130^<CAS>のc末端抗体がヒトp130^<CAS>と交差するのではと考え、ラットp130^<CAS>のc末端抗体を用いて、ヒト角膜上皮細胞とヒト角膜実質細胞の蛋白に対してウエスタンブロット法を施行した。その結果、単一の蛋白がこの抗体と交差し、その分子量がヒトp130^<CAS>の計算上の分子量とほぼ同じであったことから、以後この抗体を用いることとした。
角膜上皮細胞の接着にp130^<CAS>がどのように関わっているかを検討するために、RGDSペプチドを用いて細胞接着阻害の系を確立することを試みた。なぜなら、RGDSペプチドはα5β1インテグリンとの結合を介して上皮系細胞の接着を阻害することが知られているからである。使用する細胞としてすでに我々が確立しているSV40を導入したヒト角膜上皮細胞および水晶体上皮細胞の不死化細胞を用いることとした。驚いたことに、RGDSペプチドは水晶体上皮細胞の接着を阻害するのに角膜上皮細胞の接着は阻害しなかった。この現象がSV40と導入したためか否かを検討するため、正常の角膜上皮細胞および正常の水晶体上皮細胞を用いて同様に行ったが同じ観察結果を得た。正常の上皮細胞は継代培養が困難であることと、生じた現象が同じであったことから、この現象の詳細を検討する以後の実験にはSV40導入した不死化細胞を用いた。平成13年度はこの現象の意味するところを解明していく計画である。