2000 Fiscal Year Annual Research Report
網膜特異的蛋白の発現に関与する転写因子(RX,CRX)の転写調節機構について
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12671712
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
平田 憲 熊本大学, 医学部・附属病院・眼科, 助手 (60295144)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 光希 熊本大学, 医学部・眼科, 助教授 (70173896)
福島 美紀子 熊本大学, 医学部・附属病院・眼科, 助手 (10284770)
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| Keywords | Western Blotting / RX / CRX / 網膜 |
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| Research Abstract |
Western Blotting
(方法)
pGEX4T-1に組み込んだhumanRXを発現させ、GST-RX融合蛋白を作成した。この蛋白2mg/0.5mlをアジュバントとともにウサギに免役し、5週後に抗Rx抗体を得た。ウシ網膜、水晶体、虹彩、マウス脳、肝臓をRIPA bufferにてホモジナイズし、それぞれの組織蛋白を精製した。これら蛋白をSDS-PAGEにて電気泳動し、ブロッターにてニトロセルロース膜に蛋白をブロットしたものを1000倍希釈の抗RX抗体にてインキュベートした後、ペルオキシダーゼラベルされた抗ウサギIgG二次抗体に反応させ発色させた。
(結果)
網膜と虹彩のみで特異的に37kDaのbandが見られた。他の組織で見られたbandは抗原とincubateしたRX抗体でも見られ、非特異的なbandと思われる。
Immunohisto-chemistry
ラット眼球をパラフィン固定し、前述の抗RX抗体を用いて免疫組織染色の実験を現在進行中である。
CAT assay
レポータージーン(アレスチンプロモーター/CAT等)とエクスプレッションベクター(CMV-RXやCMV-CRX)をニワトリ胎児網膜プライマリカルチャーや網膜芽細胞、あるいはcos細胞などに導入しそれぞれの細胞内でのRXもしくはCRXのプロモーター活性を見る実験が進行中である。
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[Publications] Hirata,A.,Yonemura,N.,Hasumura,T.,Murata,Y.,Negi,A.: "Effect of infusion air pressure on visual field defects after macular hole surgery."Am J Ophthalmol.. 130. 611-616 (2000)
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[Publications] Hasumura,T.,Yonemura,N.,Hirata,A.,Murata,Y.,Negi,A.: "Retinal damage by air infusion during vitrectomy in rabbit eyes."Invest Ophthalmol Vis Sci. 41. 4300-4304 (2000)
