歯周病原性細菌によるアポトーシス様細胞死誘導のメカニズム解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12672031
• Research Institution: Tokyo Medical and DentaJ University
• Principal Investigator: 荒川 真一 東京医科歯科大学, 歯学部・附属病院, 助手 (20302888)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土田 信夫 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60089951) ; 中島 琢磨 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (90256678)
• Keywords: 殺細胞因子 / 歯周病原性細菌 / Bacteroides forsythus / G2 arrest / アポトーシス / 歯周炎

Research Abstract

1.殺細胞因子の精製
Bacteroides forsythusの超音波破砕物をDEAE Sepahroseカラムを使用し精製を行った結果、2画分(F1, F2)に活性が認められた。さらに、ゲルろ過を行ったところ、F1、F2ともに同様な分子量(28kDa, 400kDa超)の2分画に活性が認められた。F1, F2共に高分子量分画におけるA_<254>がA_<280>より高かったので、本因子は、細菌のDNAと相互作用すると予想された。そこで、400kDa超の分離分画をDNaseIと作用させ分画を行った。その結果、28kDaに収斂し活性が認められた。よって、当該毒素は、DNA結合性のタンパク質であることが強く示唆された。次に、ヘパリンカラムを用いて精製を行なったところ、強い活性を示す分画を得た。本分画に対し2.の抗体を用いてWestern blot analysisを行ったところ、約28kDaを含む3本のバンドを得た。
2.坑殺細胞活性モノクロナール抗体の作製
マウスをB. forsythusの超音波破砕物で免疫した後、リンパ球を分離した。これらのリンパ球をマウスミエローマの細胞株に融合させた。その後、一週間培養を行い、ハイプリドーマのコロニーを形成させた。これらのクローンから坑殺細胞活性を保有する抗体を産生するクローンを分離した。
3.殺細胞因子の上皮様癌細胞に対する作用の分析
上記細胞に精製した因子を作用させ位走査顕微鏡、DAPI染色により検討を行ったところ、球状を呈し、Dishから剥離・凝集しており、アポトーシス小体が観察された。さらに、cell cycle statusを検討するために、細胞をp53, Cyclin B1に対する抗体にて染色後、フローサイトメトリーにて分析した。その結果、殺細胞因子を作用させた細胞は、G2 arrestを起こし、かつ高レベルのp53, Cyclin B1の発現が認められた。
(Infect Immun.に投稿準備中)。

Research Products

• [Publications] Shinichi Arakawa: "Novel apoptosis-inducing activity in Bacteroides forsythus : a comparative study with three serotypes of Actinobacillus actinomycetemcomitans"Infection and Immunity. 68・8. 4611-4615 (2000)
• [Publications] 荒川 真一: "歯周病原性細菌の保有する細胞死誘導活性"口腔病学会雑誌. 68・1(発表予定). (2001)
• [Publications] 荒川 真一: "Bacteroides forsythusの保有するアポトーシス誘導活性について"歯科基礎医学会雑誌. 42・5. 111 (2001)
• [Publications] Shinichi Arakawa: "Induction of apoptosis by a novel factor isolated from Bacteroides forsythus"Journal of Dental Research. 79・(special issue). 233 (2000)
• [Publications] 中島 琢磨 他: "歯周病原性細菌の産生する細胞死誘導因子"歯科基礎医学会雑誌. 43・5. 88 (2001)
• [Publications] 荒川 真一: "歯周病原性細菌の産生する細胞死誘導因子の解析"日本歯周病学会雑誌. 43. 45 (2001)
• [Publications] Shinichi Arakawa: "Analysis of cell death inducing factors isolated from periodontopathic bacteria"Journal of Dental Research. 80. 768 (2001)