新規酵素免疫測定法による硫酸抱合型ニューロステロイド分析法の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12672086
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 島田 和武 金沢大学, 薬学部, 教授 (90004605)
• Keywords: 脳内ステロイドホルモン / pregnenolone 3-sulfate / 新規ハプテン / 特異的ポリクローナル抗体 / 酸素免疫測定法 / ラット脳

Research Abstract

現在、注目されている脳内物質として脳内ステロイドホルモン(ニューロステロイド)があり、そのなかでもdehydroepiandrosterone 3-sulfateやpregnenolone 3-sulfateなどの硫酸抱合型ニューロステロイドが第4世代の神経伝達物質として多大な関心が寄せられている。しかし、申請者らは、LC/MSによるこれらの分析法を開発し実試料へ適用したところ、いずれの抱合体の存在量もLM/MSの検出下限以下であり、従来の文献値より遥かに低値(1/20以下)を示すことから、本法では測定困難な事が判明した。そこで、昨年度はdehydroepiandrosterone 3-sulfateの超高感度で高選択的な新規酵素免疫測定法を開発し、やはり低濃度でしか存在しないことを明らかとした。そこで今年度はpregnenolone 3-sulfateのそれを開発した。
まず、dehydroepiandrosteroneの微生物酸化により得られる11α-hydroxy体を出発物質として、11位にブリッジを有するpregnenolone 3-sulfateに対する新規ハプテンを合成した。得られたハプテンを複数の家兎に免疫し本硫酸抱合体に特異的ポリクローナル抗体を得た。ついで、得られた抗体を用いて新規酵素免疫測定法(ELISA)を開発したが、これはブリッジヘテロロガス法と遅延添加法を駆使した超高感度、高選択的な測定法であった。また、開発した方法を実施料(ラット脳)へ適用したところ、やはり低濃度でありLC/MSのそれと近い値が得られた。

Research Products

• [Publications] Kuniko Mitamura: "Derivatization in liquid chromatography/mass spectrometric analysis of neurosteroids"Chromatography. 22(1). 11-15 (2001)
• [Publications] Tatsuya Higashi: "Studies on neurosteroids XIV. Levels of dehydroepiandrosterone sulfate in rat brain and serum determined with newly developed enzyme-linked immunosorbent assay"Steroids. 66(12). 865-874 (2001)