高分解能核磁気共鳴装置を用いた酵素リボヌクレアーゼの基質結合時の動的挙動の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12672088
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 植田 正 九州大学, 薬学研究院, 助教授 (90184928)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阿部 義人 九州大学, 医学研究院, 助手 (60315091) ; 橋本 喜夫 九州大学, 薬学研究院, 助手 (50253472) ; 井本 泰治 九州大学, 薬学研究院, 教授 (90038282)
• Keywords: 緩和解析 / NMR / 酵素誘導適合 / コドンユーセージ / リボヌクレアーゼT1 / ヒトリボクレアーゼ3 / Pichia pastoris

Research Abstract

昨年度は、^<15>Nラベル化したリボヌクレアーゼT1(RNase T1)を調製し、その^1H-^<15>N HSQCスペクトルを測定し、^<15>N核の帰属を終了した。本年度は、基質類似体共存下での^<15>N核の帰属、基質類似体共存下で基質類似体存在下及び非存在下で、プロトンの飽和時・非飽和時の^<15>N-^1H間の核オーバーハウザー効果を評価した。また、インバージョンリカバリー法やスピンエコー法にて種々の^<15>N核の縦緩和及び横緩和時間を測定した。その後、各^<15>N核の動的挙動を核オーバーハウザー効果、縦緩和及び横緩和時間を基に、モデルフリーアナリシス法を用いて、酵素の基質類似体存在下非存在下での動的挙動を比較し、基質結合に伴う分子運動の変動を評価した。基質類似体としては、RNase T1に結合する3'GMPを用いた。基質非存在下でRNase T1は全体的にオーダーパラメーターが大きく(1に近く)、RNase T1は硬い構造をもっていることがわかった。3'GMP共存下では、51,63,84近傍で動きが動大したが、43,92近傍では逆に動きが制限された。酵素-基質複合体形成時に酵素が硬い構造を取るという考えとは異なり、ニワトリ、ヒトリゾチーム、4-oxalarocrotonate tautomerase等で観察された基質類似体共存下で分子運動が大きくなるという考えを支持するものであった。一方、他のリボクヌレアーゼでも基質類似体共存下での分子運動を見積もるために、ヒトリボヌクレアーゼ(RNase3)をコードするcDNAを入手し、ベクターに組み込み、Pichia pastorisへ形質転換した株から、RNase3の大量に分泌する株を選別しようとしたが、SDS-PAGE(CBB染色)で分泌は確認されなかった。この酵素のcDNAにはPichia pastorisでほとんど使用されないArgのコドン(CGG)が含まれていましたので、これをすべてArg(AGA)に変えて、分泌発現を行ってみたが分泌は確認されなかった。

Research Products

• [Publications] Ohmura T., Ueda T., Hashimoto Y., Imoto T.: "Tolerance of point substitution of methionine for isoleucine in hen egg white lysozyme"Protein Eng.. 14・6. 421-425 (2001)
• [Publications] Ueda T., Nagata M., Imoto T.: "Aggregation and chemical reaction in hen lysozyme caused by heating at pH 6 are depressed by osmolytes, sucrose and trehalose"J. Biochem.. 130・4. 491-496 (2001)
• [Publications] Ohkuri T., Ueda T., Tsurumaru M., Imoto T.: "Evidence for an initiation site for hen lysozyme folding from reduced form using its dissected peptide fragments"Protein Eng.. 14・11. 829-833 (2001)