外来染色体を転座型で安定に維持できるマウスES細胞の作製

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12672200
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 押村 光雄 鳥取大学, 医学部, 教授 (20111619)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 基伸 鳥取大学, 医学部, 助手 (00273904)
• Keywords: 10番染色体 / TCマウス / 染色体安定性 / 転座 / DT40 / ターゲティング / Cre-LoxP

Research Abstract

ヒト染色体を導入したマウスES細胞より作製されたTranschromosomic(TC)マウスは,ヒト型代謝系を再現するマウスの作製,ヒト型免疫系を持つマウスの作製,ヒト遺伝子(群)のin vivoでの解析等への幅広い応用を可能とした。しかし,選択培養を行わなければ外来染色体の脱落が高頻度で生じること,マウス個体ではそのような選択操作が出来ないこと,外来染色体の子孫への伝達が困難なこと等の問題点がある。これらの問題点を克服し,安定に外来染色体を維持,子孫への伝達可能なシステムの構築を目的として,loxP配列をマウス染色体テロメア近傍に組み込んだES細胞を作製した。このようなES細胞を用いることによって,外来染色体にもあらかじめloxP配列を組み込んでおけば,ES細胞中でCre酵素によるマウス染色体と相互転座を起こさせることが可能となり,転座型で外来染色体を安定に維持させることが期待できる。実際にヒト11番染色体短腕をマウス染色体に転座させたES細胞を一つの例として作製した。マウス個体での安定性,子孫への伝達,ヒト染色体上の遺伝子の発現や機能の解析を行い,このシステムの有用性を検討した。方法を以下に記した。
マウス10番染色体テロメア近傍のDNAマーカーを用いて,マウスゲノムライブラリーをスクリーニングした。マウスゲノム・PGKNwo・loxP・HPRT遺伝子のエクソン3〜9・マウスゲノム・PGKtkの順でターゲティングコンストラクトを構築した。得られたコンストラクトでHPRT(-)のマウスES細胞にトランスフェクションした。G418とFIAUを含む培地で選択培養を行い,ターゲティングに成功したクローンを得た。さらにMMCTを用いて,pSV2Neoで標識されたヒト11番染色体をニワトリDT40細胞へ導入した。ヒトゲノム・HPRT遺伝子のエクソン1〜2・loxP・PGKtk・ヒトゲノムの順でターゲティングコンストラクトを構築した。コンストラクトをヒト11番染色体を保持するDT40細胞へトランスフェクトし,ハイグロマイシンおよびG418を含む培地で選択培養を行い,ターゲティングに成功したクローンを得た。

Research Products

• [Publications] Shinohara,T., et al.: "Stability of human chromosome fragments in cultured cells and in mice"Chrom.Res.. 8. 713-725 (2000)
• [Publications] Shinohara T., et al.: "Mice containing a human chrmosome 21 model behavioral impairment and cardiac anomalies of Down syndrome"Hum.Mol.Genet.. (in press).