筋萎縮性側索硬化症誘発物質による神経細胞死発現機構の解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12672227
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 伊藤 芳久 日本大学, 薬学部, 助教授 (50151551)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石毛 久美子 日本大学, 薬学部, 助手 (40212873)
• Keywords: PC12細胞 / 4-hydroxynonenal / アミロイドβタンパク質 / 細胞死 / s-allylcysteine

Research Abstract

12年度は、はじめに、各種初代培養神経細胞(脊髄、海馬、小脳)での検討の前段階として、PC12細胞において4-hydroxynonenal(HNE)誘発細胞死の検討を行った。神経成長因子(NGF)で分化させたPC12細胞において、HNE12.5、25、50μMを添加し24時間後にMTT法により細胞生存率を測定したところ、濃度依存的な細胞死が観察された。さらに、プロピジウムイオダイド(PI)とHoechst 33342による共染色の後、蛍光顕微鏡で観察したところ、HNEの濃度に依存して、PIで染色される死細胞の数が増加した。また、アミロイドβタンパク質(Aβ)1または5μMの添加により、同様の細胞死が認められた。HNE誘発細胞死とAβ誘発細胞死を比較検討するために、ニンニクの成分であるs-allylcysteine(SAC)をHNEまたはAβと同時に培地に添加したところ、HNEの低濃度(12.5または25μM)による細胞死には軽微な抑制傾向を示したが、高濃度HNE(50μM)では影響を及ぼさなかった。Aβ誘発細胞死に対して、SACは濃度依存的な細胞死抑制作用を示し、1または10μMの添加では、コントロールレベルまで回復した。このことから、HNEとAβは、異なるメカニズムによって細胞死を引き起こす可能性が示唆された。さらにゲル・メンブレン用自動検出処理機を導入し、HNEまたはAβ添加後のcyclic AMP responsive element(CRE)およびactivator protein 1(AP-1)DNA結合活性の挙動をゲルシフト法で、またアポトーシスに関与するCaspase 3の変化をウエスタンブロット法で現在検出中である。培養海馬神経細胞においてもHNEによる細胞死を確認できたので、今後はこの初代培養系細胞を用いて検討を行う予定である。