筋小胞体カルシウムポンプのN末端ドメインによる折りたたみの安定化機構

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680602
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 講師 (90207267)
• Keywords: カルシウムポンプ / 筋小胞体 / SERCA / 部位特異的変異 / protease / アルギニン / バリン / ジスルフィド

Research Abstract

筋小胞体カルシウムポンプはATPの加水分解に共役してCa^<2+>を能動輸送する。本酵素はCa^<2+>非結合型酵素へのCa^<2+>結合により活性化され(Ca^<2+>結合型酵素)、ATPによりリン酸化されADP-感受性型リン酸化酵素を形成する。そのADP-非感受性型リン酸化酵素への構造変化に伴ってCa^<2+>を輸送し、その後脱リン酸化され、Ca^<2+>非結合型に戻る。
筆者は、本酵素のN末端の小領域Ala3-Thr9に1-2残基以上の削除変異または特異的置換変異をいれるとCOS-1細胞中での発現量が抑えられ、それは小胞体品質管理により変異蛋白質が迅速に分解を受けるためであることを見出した。これより、この小領域が本酵素のfoldingに重要であることを示した。そこで、in vitroの系で詳細にprotease感受性を調べることによって、本酵素のfoldingあるいは構造(変化)に関する知見を得ることができると考えた。
ウサギ骨格筋より調整した本酵素をCa^<2+>の非存在下にてproteinase K、V8 protease、またはtrypsinで消化すると、リン酸化されていない酵素は迅速に分解された。これに対し、無機燐酸(P_i)から形成したADP-非感受性型リン酸化酵素、およびそのアナログである、酵素にフッ素またはorthovanadateが結合したものでは、trypsinによるT1部位(Arg505)の切断を除いてこれらのprotease切断に対し完全な抵抗性を示した。この結果は、上記リン酸化酵素、およびそのアナログでは、本酵素が非常にcompactな構造をとっていることを示している。これは、Toyoshimaら(Toyoshima et al.(2000)Nature 405,647-655)によって結晶構造解析から提唱されているcytoplasmic domain(A、P、N)の大きな動きとあっている。また、これらのproteaseに対する感受性をみることにより、decavanadateを結合した本酵素の構造も上記リン酸化酵素のそれと非常に似ていることが示された。他方、カルシウムポンプをCa^<2+>非結合型に固定する阻害剤thapsigarginはこれらの消化のtime courseに影響せず、抵抗性を示さなかった。このことは、Ca^<2+>非結合型酵素とADP-非感受性型リン酸化酵素では構造が大きく異なることを示している。

Research Products

• [Publications] Stefania Danko: "ADP-insensitive phosphoenzyme intermediate of sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase has a compact conformation resistant to proteinase K.V8 protease and trypsin"FEBS Lett.. 489・2-3. 277-282 (2001)
• [Publications] H.Suzuki: "Only half of the Ca^<2+>-ATPase molecules present in sarcoplasmic reticulum vesicles can be phosphorylated with ATP or inorganic phosphate"Na/K-ATPase and Related ATPases Proceedings of the 9th International Conference on the Na/K-ATPase and Related ATPases Editors : K.Taniguchi and S.Kaya. 381-388 (2000)
• [Publications] T.Daiho: "Deletions or specific substitutions of a few residues in the NH_2-terminal Ala3-Thr9 region of sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase cause inactivation and rapid degradation of the enzyme expressed in COS-1 cells"Na/K-ATPase and Related ATPases Proceedings of the 9th International Conference on the Na/K-ATPase and Related ATPases Editors : K.Taniguchi and S.Kaya. 293-296 (2000)
• [Publications] K.Yamasaki: "Mutations of arginine-198 in sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase cause inhibition of hydrolysis of the phosphoenzyme intermediate formed from inorganic phosphate"Na/K-ATPase and Related ATPases Proceedings of the 9th International Conference on the Na/K-ATPase and Related ATPases Editors : K.Taniguchi and S.Kay a. 297-300 (2000)
• [Publications] 大保貴嗣: "筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのC876-C888ジスルフィド結合はATP加水分解とCa^<2+>輸送の共役に重要である"生化学. 72・8. 887-887 (2000)
• [Publications] 上堂地美佳: "筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのVal-200への部位特異的変異導入はCa^<2+>-ATPase活性を抑制する"生化学. 72・8. 886-886 (2000)
• [Publications] 山崎和生: "筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのマグネシウム・フッ素複合体は筋小胞体Ca^<2+>非存在下でのC_<12>E_8による可溶化に対して安定である"生化学. 72・8. 887-887 (2000)