2000 Fiscal Year Annual Research Report
DNAメチル化がヌクレオソーム局在に与える影響の解析
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12680668
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小村 潤一郎 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (10215410)
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| Keywords | ヌクレオソーム / ソラレン / フットプリント |
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| Research Abstract |
高等真核細胞の単一コピー遺伝子上において、ヌクレオソームのin vivoでの存在位置を塩基配列レベルで決定するフットプリント法を確立した。
この方法の概要は、次のようなものである。培養細胞をソラレンと長波長紫外線で処理すると、DNA上のヌクレオソームのない場所(リンカー)にのみ鎖間クロスリンクが生成する。ゲノム内の特定遺伝子上のクロスリンクを、最終的にシークエンスゲル上にバンドとして塩基配列レベルで表示するが、バンドのない場所がヌクレオソームの存在位置ということになる。クロスリンクを持つDNA2本鎖は、加熱しても完全には解離せず、温度を下げると急速に(プライマーがアニールする前に)もとの2本鎖に戻ってしまうため、PCRなどが適用できない。そこで、前処理でクロスリンクを取りはずして他の形に転換することが必要である。そのためアルカリ中で加熱を行うが、この処理により、非対称分子であるソラレンは、片側でDNA鎖よりはずれ、反対側でのみDNA鎖に結合した普通の付加体になる。この付加体の位置を、私たちが開発したterminal transferase-dependent PCR法で決定する。この方法は、一種のpolymerase stop assayである。遺伝子特異的プライマーからの伸長反応は付加体の場所で停止するが、このとき生ずる1本鎖DNA産物をシークエンスゲル上に表示する。鋳型がゲノムDNAのため、産物はきわめて微量であり、2段階の増幅が行う。
この方法を用い、ヒトc-FOS遺伝子のプロモーターにおいて、クロスリンク生成が抑制される広い領域を検出したが、これは実際に、ヌクレオソーム存在部位と考えられているところに相当していた。
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