真核生物のバイパスDNA合成に関与するDNAポリメラーゼ・ゼータの生化学的解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680676
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 秋山 昌広 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (80273837)
• Keywords: 損傷乗り越えDNA複製 / バイパスDNA合成 / 複製フォーク / アフリカツメガエル卵母細胞 / スライディングクランプ / DNA損傷 / DNAポリメラーゼ / 突然変異

Research Abstract

複製フォークの進行停止を回避する経路のひとつにバイパスDNA合成機構(損傷乗り越えDNA複製機構)があり、真核生物では従来の複製型DNAポリメラーゼとは性質の異なるDNAポリメラーゼ ζ(ゼータ)が関与している。これまで明らかにされていない脊椎動物におけるバイパスDNA合成機構の解明を目的として、本研究では1:アフリカツメガエルのDNAポリメラーゼζの精製、および2:DNAポリメラーゼζの作用機構の検討を行う。
1.アフリカツメガエルの卵母細胞からDNAポリメラーゼζをホロ酵素として単離するため、カラムクロマトグラフィーによる触媒サブユニットREV3蛋白質の精製を目指した。REV3蛋白質の検出は、抗REV3抗体によるウエスターンブロットや免疫沈降により行った。しかし、卵母細胞抽出液中にREV3蛋白質を同定できなかった。現在、エピトープの異なる新たな抗体を作製している。さらに、酵素学的手法によるREV3蛋白質の同定も試みている。
2.DNA損傷で停止した複製フォークをバイパスDNA合成により回復する機構には、複製装置に含まれるPCNAクランプがキーファクターとして働く可能性がある。REV3遺伝子の一部分を大腸菌で発現させてREV3部分蛋白質を精製して、REV3蛋白質とPCNAの相互作用の検討を目指した。しかし、大腸菌でREV3遺伝子を発現できなかった。そこで、まず発現系の検討を行い、コドンバイアスの補正と可溶化促進タグにより大腸菌を用いたREV3遺伝子発現系の構築に成功した。今後、REV3部分蛋白質を作製してPCNAとの相互作用を検討する予定である。