14-3-3ファミリーの細胞内標的分子のプロテオーム解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680748
• Research Institution: Tokyo Metropolitan University
• Principal Investigator: 市村 徹 東京都立大学, 理学研究科, 助教授 (50213012)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 磯辺 俊明 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (70106607)
• Keywords: 14-3-3タンパク質 / 細胞内シグナル伝達 / タンパク質リン酸化反応 / タンパク質キナーゼ / PC12細胞 / プロテオーム解析 / プロテオミクス

Research Abstract

14-3-3ファミリーは、モノアミン合成系の酵素から核内因子に至まで、多くの標的酵素・タンパク質とリン酸化反応に依存して複合体を形成するが、その標的にはRasの上流・下流に位置するガン関連遺伝子や、受容体チロシンキナーゼに連結した一連のシグナル伝達分子が含まれる。申請者らは14-3-3ファミリーは、複数のシグナル伝達経路を結合する"コーディネーター"であると推定している。この仮説を実証することがシグナル伝達系でのこのファミリーの役割や作用についての理解を深め、最近の話題でもある細胞内情報伝達ネットワークのクロストークの実体を明らかにするために重要と考える。本研究ではmyc-tag標識した14-3-3ηアイソフォームを安定に発現しているPC12細胞株(PC12-14e株)を用いて実験を行なった。14-3-3ηと複合体を形成している標的蛋白質は、この細胞溶解液から、myc抗体を用いて免疫沈降することで回収し、SDS-PAGEまたほ二次元電気泳動で分離した後、銀染色によって検出した。また、複合体形成を阻害するアミノ酸変異(E185→K)を導入したmyc-14-3-3ηを用いて同様の実験を行ない、相互作用の特異性を評価するためのコントロールにした。本方法により、少なくとも30種の標的蛋白質が14-3-3ηに特異的に結合していることが分かった。そこで、これらの標的蛋白質をゲル内で酵素消化した後、フラグメントを抽出し質量分析計を用いて同定した。また同定したタンパク質の内、チロシン水酸化酵素とキネシンモー夕ー夕ンパク質に注目し、相互作用の特異性と分子機構を明らかにした。今後は、同定したすべての標的分子を網羅的に解析することで、このファミリーの生理的役割を明らかにする予定でいる。

Research Products

• [Publications] Ichimura T. et al.: "Interaction of tyrosine hydroxylase and 14-3-3 proteins in PC12 cells"Catecholamine Pesearch. (in press).
• [Publications] Ichimura T. et al.: "Phosphorylation-dependent interaction of kinesin light chain 2 and the 14-3-3 protein"Biochemistry. (in press).