GFPノックインマウスを用いたGABAニューロン形成と移動の分子基盤

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680789
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 柳川 右千夫 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助教授 (90202366)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小幡 邦彦 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 教授 (60013976)
• Keywords: GABAニューロン / グルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子 / トランスジェニックマウス / GFP / ノックインマウス / 標織 / プロモーター / lacZ遺伝子

Research Abstract

GABAニューロンの形成過程およびその移動パターンを解明する目的で、マウス個体におけるGABAニューロンの標識法について検討した。具体的には、GABAニューロン特異的に発現しているグルタミン酸脱炭酸酵素(GAD;GAD65とGAD67の2型存在)遺伝子、レポーター遺伝子としてβ-ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子或いはgreen fluorescent protein(GFP)遺伝子を利用した遺伝子改変マウスの作成を行った。
(1)GAD65-lacZ融合遺伝子トランスジェニックマウスの作成と解析
9.4kbのプロモーター領域を含むGAD65遺伝子上流域にlacZ遺伝子を連結した融合遺伝子をマウス受精卵に導入することにより4系統の独立したトランスジェニックマウスを作成した。lacZ遺伝子の臓器特異的発現について検討した結果、脳と精巣に特異的に発現おり、GAD65の発現様式と一致した。さらに、脳における細胞特異的発現について検討した結果、小脳と嗅球ではGAD65の発現様式と一致したが、GAD65の発現している視床や視床下部ではlacZの発現が認められなかった。以上の結果は、GAD65遺伝子上流域は、一部のGABAニューロンの標識には適しているが、すべてのGABAニューロンの標識には上流域に加えて他の領域も必要であることが示唆された。
(2)GAD67遺伝子-GFPノックインマウスの作成
GAD67遺伝子にGFP遺伝子をノックインしたコンストラクトを作成し、ES細胞に導入することにより、相同組み換えによるGAD67遺伝子-GFPノックインしたESクローン13個を同定した。これらのクローンをマウス8細胞期胚に注入することによりキメラマウスを作成し、キメラマウスと野生型マウスとを交配することにより1匹のキメラマウスからES細胞由来の仔を得た。今後は、これらの仔のゲノタイピングを行い、ノックインマウスかどうかを同定する。さらに、ノックインマウスについて脳組織標本を作成し、GABAニューロンに一致したGFPの発現の有無について検討する。

Research Products

• [Publications] Makinae,K.,Kobayashi,T.,Yanagawa,Y. et al.: "Structure of the Mouse Glutamate Decarboxylase 65 Gene and its Promoter : Preferential Expression of its Promoter in the GABAergic Neurons of the Transgenic mice."J.Neurochem.. 75. 1429-1437 (2000)
• [Publications] Yamanaka,H.,Maehira,F.,Oshiro,M.,Asato,T.,Yanagawa,Y. et al.: "A possible interaction of thioredoxin with VDUP1 in HeLa cells detected in a yeast two-hybrid system."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 271. 796-800 (2000)
• [Publications] Obata,K.,Yanagawa,Y.,and Makinae,K.: "Control and Diseases of Sodium Dependent Transportation Proteins and Ion Channels"Elsivier,Amsterdam. 377-381 (2000)