内因性阻害物質を分子プローブとした活性型フェノールオキシダーゼの機能構造解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12760078
• Research Institution: Saga University
• Principal Investigator: 佐藤 孝 佐賀大学, 農学部, 講師 (20274582)
• Keywords: フェノールオキシダーゼ / 活性型 / インヒビター / 蛍光 / アフィニティー / 迅速精製 / イエバエ / ペプチド

Research Abstract

本研究は、生体内での必須の役割が考えられてきたにもかかわらず、その高い活性に由来する不安定さより構造・機能両面において詳細な知見を得る事が未だ困難である活性型フェノールオキシダーゼ(PO)をターゲットとする、多機能分子プローブの設計・合成及び評価を目的として行なっている。
平成12年度は、この多機能プローブの設計・合成に重点を置き研究を進めた。すなわち、合成フェノールオキシダーゼインヒビター(POI)を親分子とし、まずそのN末端及び分子内に含まれる3つのLys残基を蛍光試薬で修飾した分子を合成して、これらのターゲット分子結合特性について、蛍光偏向解消測定により検討を行なった。活性残基であるDopa^<32>のごく近傍に存在するLys^<34>を修飾した場合を除き、合成した蛍光POIは天然POIとほぼ同等の強い結合特性を示した。また、これら修飾分子は、PO粗酵素抽出液中でも高い活性を示し、POと特異的に結合し、若干の解離は見られるもののPO-蛍光標識POI複合体がゲルろ過において鮮やかなバンドとして安定分離できる事を確認した。また、蛍光修飾POIビオチン結合分子についても予備的な合成を行ない、本分子がアビジン-ビオチンアフィニティーカラムクロマトグラフィーに適応可能である事が示された。現在、本分子プローブの多機能化を進めその評価結果を元に微調整を行なう一方で、同時に蛍光標識POIを用いPO-POI複合体の精製を行い、酵素-ペプチド複合体の結晶化の準備を進めている。
今後、本分子プローブの特性を生かしたペプチド蛋白質複合体の迅速精製手順の確立を行なうとともに、Lys残基の光架橋性残基への置換体の合成を進め、最終的な機能構造解析を行なう予定である。