カルシウム遊離に伴うin situ小胞体の電気的挙動に関する光学的手法による解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12770025
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 白川 英樹 東京女子医科大学, 医学部・機能学系・生理学(第二), 助手 (40241070)
• Keywords: 細胞内カルシウム / イノシトール三リン酸 / 小胞体 / 膜電位 / 蛍光測定

Research Abstract

IP_3受容体Caチャネルを介した小胞体(ER)からのCa遊離の過程を理解するためには、ER内外のCa濃度差だけでなく、電位差(=ER膜電位)をも考慮して電気化学的現象としてとらえることが重要である。本研究では、膜電位感受性蛍光色素を用いてハムスター卵細胞におけるIP_3依存性Ca遊離の際のER膜電位変化を光学的に測定する、というアプローチを行っている。ハムスター卵は、リアノジン受容体系は存在せずIP_3受容体系のみである、細胞内のERの分布が均一である、などモデル系としての利点がある。
本年度の研究において、以下のような成果が得られた。
(1)Stylyl系膜電位依存性蛍光色素di-18:2-ANEPPSは、大豆油に飽和させた状態で卵細胞質内に注入すると、徐々にER膜に移行した。さらに色素はER膜上を拡散し、約30分のうちに卵内のER全体が染色された。それに対して細胞膜は全く染色されなかった。この方法により、ER膜電位の蛍光シグナルを選択的に得ることができた。
(2)Stylyl系色素からの膜電位依存性シグナルを、2波長励起および2波長蛍光のレシオ記録によって測定する光学系を確立した。これによって、色素の退色や励起光強度の変動に由来するノイズ成分が排除され、S/Nが良く安定した光学的膜電位記録が可能になった。
(3)IP_3を細胞質内に注入してCa遊離を誘発し、その際の変化を測定したところ、ER内陰性の向きのER膜電位変化を示す蛍光レシオシグナルの変化が、2波長励起および2波長蛍光の両方のモードで記録された。
(4)細胞質中に4-AP,TPAなどのKチャネル阻害剤を投与しておくと、IP_3誘発性Ca遊離は抑制された。しかしその効果は弱いことから、ER膜上のKチャネルはCa遊離の際の電位勾配形成を軽減はするが、完全に相殺するだけの能力はもたないことが示唆された。

Research Products

• [Publications] Shirakawa H.and Miyazaki S.: "Optical measurement of endoplasmic reticulum membrane potential during Ca^<2+> release"Japanese Journal of Physiology. 50(Suppl). (2000)
• [Publications] 白川英樹,宮崎俊一: "IP3誘発性Ca遊離に伴う小胞体膜電位変化"生物物理. 40(Suppl). S87 (2000)
• [Publications] Mohri T.,Shirakawa H. et al.: "Analysis of the Mn^<2+>/Ca^<2+> influx and release during Ca^<2+> oscillations in mouse eggs injected with sperm extract"Cell Calcium. (in press). (2001)