PCR-SSCP法を用いた三日熱マラリア伝播阻止ワクチン抗原変異の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12770125
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 橘 真由美 愛媛大学, 医学部, 教務職員 (00301325)
• Keywords: マラリア / PCR-SSCP法 / 伝搬阻止ワクチン / オーキネート

Research Abstract

マラリアワクチン開発において、流行地のマラリア原虫におけるワクチン抗原の抗原変異を広範に解析しておくことは必須の研究課題である。本研究では、多数の検体の抗原変異解析を簡便に行えるPCR-SSCP法を応用し、三日熱マラリア流行地におけるマラリア伝搬阻止ワクチン抗原であるオーキネート表面蛋白の抗原変異を解析することを目的とした。まずPCR-SSCP法の条件の至適化を行う為に、三日熱マラリア伝搬阻止ワクチン抗原Pvs25及びPvs28遺伝子の全長を増幅できるPCRプライマーを合成した。三日熱マラリア原虫バングラデシュ分離株を用いた抗原変異解析から得られた4種類のPvs25遺伝子及び、16種類のPvs28遺伝子のプラスミドクローンを陽性コントロールとし、これらを鋳型としたPCRにより得られたDNAの電気泳動を行い、銀染色によって検出した。その結果、Pvs25では4種全ての遺伝子変異がこの方法を用いて検出できた。一方、Pvs28は全体を増幅すると、約5種類に分類できたのみであった。そこで制限酵素BsmIでPvs28のPCR産物を3本に切断した後SSCP分析を行った。その結果16種類のうち少なくとも12種類が分類可能となった。この方法を用いて、タイの流行地におけるPvs25及び、Pvs28遺伝子の抗原変異の解析を行った。得られた18個のタイ分離株からPvs25及びPvs28遺伝子をPCR増幅し、確認のため直接その塩基配列を解析した。その結果、Pvs25遺伝子には3種類、Pvs28遺伝子には12種類が見出され、そのいずれも上記で確立されたPCR-SSCP法によって解析可能であった遺伝子型のいずれかと同一であった。以上の結果から、本研究で確立されたPCR-SSCP法に基づく抗原変異解析法は、点突然変異が複数存在する様なマラリアワクチン抗原の変異解析に有用であることが示唆された。

Research Products

• [Publications] Tachibana M. et al.: "Presence of three distinct ookinete surface protein genes, Pos25, Pos28-1, and Pos28-2, in Plasmodium ovale"Mol. Biochem. Parasitol.. 113. 341-344 (2001)