髄液中の異常プリオン蛋白のImmuno-PCR法検出によるプリオン病診断法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12770320
• Research Institution: 佐賀医科大学
• Principal Investigator: 黒原 和博 佐賀医科大学, 医学部, 助手 (50264172)
• Keywords: クロイツフェルト・ヤコブ病 / プリオン病 / プリオン / 迅速診断 / 脳脊髄液 / Immuno-PCR法

Research Abstract

クロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳脊髄液に極めて微量に存在すると推定される異常プリオン蛋白質の検出を目的として、Immuno-PCR法を開発中である。
まず、一次抗体として異常プリオン蛋白特異的モノクロナル抗体、15B3をPCR用チューブに固相化し、未処理の試料(クロイツフェルト・ヤコブ病患者脳脊髄液)を反応させ、二次抗体として、ビオチン化抗プリオン蛋白モノクロナル抗体、B-3F4を用いる系で、Immuno-PCR法を行った。抗原抗体反応の各段階およびPCRの各段階で様々な条件の調整を行った。感度を上げると偽陽性反応が出現し、感度を下げると疾患試料でも検出が一定しなかった。
次に、検出感度と特異性の向上を目的として脳脊髄液試料の前処理を試みた。試料にリン酸タングステンとカルシウムを加えて異常プリオン蛋白を析出させ、グルタルアルデハイドでコーティング処理したPCR用チューブに固相化した。さらにプロテアーゼK処理で正常プリオン蛋白を消化した後、残った異常プリオン蛋白質をグアニジンチオシアネート処理で変性させて抗体との反応性を向上させた。この方法でも、抗原抗体反応の各段階およびPCRの各段階で様々な条件の調整を行ったが、感度を上げると偽陽性反応が出現し、感度を下げると疾患試料でも検出が一定せず、現在までのところ、臨床応用可能な検出システムは確立していない。
現在、抗プリオン蛋白抗体を別のものに変更して実験を継続中である。また、別の研究機関で確立された抗プリオン蛋白抗体の提供を受けられるように交渉中である。