16SrDNA検出による羊水細菌感染の診断とサイトカイン、抗菌物質の検討

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12770928
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 荒井 忠士 北里大学, 医学部, 助手 (20276075)
• Keywords: 16SrDNA / 羊水 / サイトカイン / PCR / Universal primer / DNAシークエンス / 子宮内感染 / 絨毛羊膜炎

Research Abstract

羊水中細菌増殖は早産治療と胎児予後を左右するが、培養の偽陰性率が高く迅速性に欠けることが問題となる。そこで全ての細菌が保有する16SrRNAをコードするDNAフラグメントをPCR法により検出する一方、16SrDNA陽性例が感染の重症度を反映するか検討するために、羊水中サイトカイン濃度と比較し迅速診断法として有用か検討することを目的とした。
切迫早産、前期破水37例に肺成熟、細菌の有無を確認する目的で経腹的羊水穿刺を行って得られた羊水をインフォームドコンセントを得て本研究に供した。遠心後の上清でELISA法による羊水中IL6,IL8濃度測定を行った。また沈渣よりDNAを抽出後universal primerを用いて、16SrDNAをPCR法で増幅し、その産物を直接およびサブクローニングし得られたプラスミドDNAの両者でDye terminator法を行いDNAシークエンスを決定し、比較するとともに細菌の混合感染の有無を検討した。
陽性は23例、陰性は14例であった。陽性群の羊水中IL6およびIL8濃度は有意に高濃度を示した(IL6:43.3±8.8vs14.1±7.1ng/ml p<0.03、IL8:34.1±10.3vs
2.7±1.1ng/mlp<0.03)。8例(35%、未破水6、前期破水2)には複数の細菌が検出され、PCR産物のダイレクトシークエンスでは細菌が特定できず、サブクローニングを必要とした。
未破水例でも複数の細菌が存在する可能性があり、正確な同定にはサブクローニングが必要と考えられた。しかし羊水中サイトカイン濃度が、陽性例で高値を示すたことから両者の併用や他の炎症マーカーの併用により胎児への危険度が判定可能であり、迅速診断として有用であることが示唆された。