2000 Fiscal Year Annual Research Report
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12771073
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
松崎 恭一 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (20278013)
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| Keywords | Basonuclin / 創傷治癒 / 角膜 / 結膜 / 増殖 / 分化 / Zinc finger / Transcription factor |
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| Research Abstract |
1.眼球の摘出
ペントバルビタール30mg/kgを尾静脈から投与しラットを麻酔後、眼瞼を付着させた状態で眼球を摘出した。
2.免疫組織染色
採取した検体をO.C.T.Compound(Tissue Tek【○!R】,SAKURA)に入れ、急速凍結後、6μmの凍結切片を作製した。次に-20℃のアセトン・メタノール(1:1)で15分間固定した後、二次抗体によるアーチファクトを最小限にするためavidin/biotin blocking kit【○!R】(Vector Laboratories,USA)を使用した。Basonuclin抗体はRabbit polyclonal anti-human Basonuclinを使用した。この抗体を5%牛胎児血清アルブミン-等張性リン酸緩衝液(5%BSA-PBS)で100倍に希釈後、4℃で一晩検体をインキュベーションした。次に、5%BSA-PBSで20,000倍に希釈したGoat anti-Rabbit IgG-Biotin(Pierce Chemical Co.,USA)で室温で1時間インキュベーションした。さらに5%BSA-PBSで10,000倍に希釈したStreptavidin-Cy3(Pierce Chemical Co.,USA)で室温で1時間インキュベーションした。各染色間には0.1%NP40-PBSで3回洗浄した。さらに1μg/mlのHoechst33258(Fluka,USA)で5分間インキュベーションを行いDNAを染色後、螢光顕微鏡で観察した。
3.結果
角膜では基底層とその直上の層の細胞の核に濃染したBasonuclinがみられた。眼瞼結膜では基底層とその直上の層の細胞の細胞質に濃染したBasonuclinがみられた。他の結膜ではわずかに染色されたBasonuclinが細胞質にみられた。
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