2001 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
12771073
|
|---|
| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
松崎 恭一 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (20278013)
|
|---|
| Keywords | Basonuclin / 創傷治癒 / 角膜 / 結膜 / 増殖 / 分化 / Zinc finger / Transcription factor |
|---|
| Research Abstract |
1.角膜潰瘍の作製
ペントバルビタール30mg/kgを尾静脈から投与しラットを麻酔後、1-Heptanolを浸した直径1mmの濾紙を角膜に1.5分間接触させ角膜潰瘍を作製した。次いで健常部を含め潰瘍辺縁を経時的に採取した(術後12時問、1、3、5、7、14日)。
2.眼球の摘出
CO_2で屠殺後、眼瞼を付着させた状態で眼球を摘出した。
3.免疫組織染色
採取した検体をO.C.T. Compoundに入れ、急速凍結後、6μmの凍結切片を作製した。次に-20℃のアセトン・メタノール(1:1)で15分間固定した後、二次抗体によるアーチファクトを最小限にするためavidin/biotin blocking kitを使用した。Basonuclin抗体はRabbit polyclonal anti-human Basonuclinを使用した。この抗体を5%牛胎児血清アルブミンー等張性リン酸緩衝液(5%BSA-PBS)で100倍に希釈後、4℃で一晩検体をインキュベーションした。次に、5%BSA-PBSで20,000倍に希釈したGoat anti-Rabbit IgG-Biotinで室温で1時間インキュベーションした。さらに5%BSA-PBSで10,000倍に希釈したStreptavidin-Cy3で室温で1時間インキュベーションした。各染色間には0.1%NP40-PBSで3回洗浄した。さらに1μg/mlのHoechst33258で5分間インキュベーションを行いDNAを染色後、螢光顕微鏡で観察した。
4.結果
角膜健常部では基底層とその直上の層の細胞の核に濃染したBasonuclinがみられた。潰瘍辺縁部で明らかなBasonuclinの局在の変化はみられなかった。
|
