オキシトシナーゼサブファミリーに属する新規酵素の生理機能の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12771424
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 服部 明 理化学研究所, 細胞生化学研究室, 研究員 (50300893)
• Keywords: アミノペプチダーゼ / オキシトシナーゼ / 胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ / 脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ / オキシトシナーゼサブファミリー / 遺伝子構造 / プロモーター領域 / X線結晶構造解析

Research Abstract

前年度の解析において、ヒト脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ(A-LAP)遺伝子の構造を明らかにしたため、本年度は遺伝子のプロモーター領域の解析を行った。その結果、ヒトA-LAP遺伝子は少なくとも2カ所から転写が開始されることが明らかとなった。また、転写開始点上流にはTATAあるいはCAATT boxが存在しなかったが、典型的なイニシエーター配列と種々の転写因子結合部位が存在していた。レポーターアッセイによってプロモーター活性を有する領域を決定した結果、転写開始点上流の-248から-176bpまでの領域が重要であることが明らかになった。また、A-LAPはインターフェロンによって発現亢進を受けることも見いだし、さらに上述のヒトA-LAP遺伝子の5' flanking regionにはインターフェロンによって調節を受けうる領域が存在していたことから、この領域の役割を検討した。しかしながら、本領域のインターフェロンによる調節は認められなかったため、今後は下流域についても同様の解析を進める予定である。
A-LAPの立体構造を解明するためX線結晶構造解析を進めた。当初、CHO細胞を用いて大量発現させたA-LAPタンパク質を材料に用いたが、結晶化するものの解析に十分な回折データを得ることができなかった。その原因として、タンパク分子に結合している糖の影響が考えられたため、含有糖鎖量を減らしたタンパク質の発現を試みた。まず、野生型A-LAPに結合している糖鎖について解析したところ、野生型には4本のアスパラギン結合型糖鎖が結合していることがわかった。さらに詳細に解析した結果、最もアミノ末端に存在する糖鎖は、タンパク質の分泌、安定性に大きく関与していることが明らかになった。そこでX線結晶構造解析に向けて、アミノ末端のみに糖を残した遣伝子組み換え型A-LAPの大量調製系を確立・精製後、結晶化および構造解析へと順次進める予定である。

Research Products

• [Publications] Matsumoto H., et al.: "Expression of placental leucine aminopeptidase/oxytocinase in neuronal cells and its action on neuronal peptides"Eur. J. Biochem.. 268. 3259-3266 (2001)
• [Publications] Hattori A., et al.: "Genomic organization of the human adipocyte-derived leucine aminopeptidase gene and its relationship to the placental leucine aminopeptidase/oxytocinase gene"J. Biochem.. 130. 235-241 (2001)
• [Publications] Hattori A., et al.: "Molecular cloning andcharacterization of adipocyte-derived leucine aminopeptidase"Cell-surface Aminopeptidase. 339-343 (2001)
• [Publications] Tsujimoto M., et al.: "Biochemical characterization of placental leucine aminopeptidase/oxytocinase and its related enzyme, adipocyte-derived leucine aminopeptidase"Cell-surface Aminopeptidase. 265-274 (2001)
• [Publications] Tsujimoto M., et al.: "Encyclopedia of Molecular Medicine"Leucine aminopeptidase. 2 (2001)