7回膜貫通型受容体の蛋白間相互作用の解析とその生理的意義

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12771429
• Research Institution: National Research Institute for Child Health and Development
• Principal Investigator: 平澤 明 国立小児病院, 小児医療研究センター・小児薬理研究部, 研究員 (70242633)
• Keywords: α1Aアドレナリン受容体 / α1Bアドレナリン受容体 / yeast two-hybrid法 / Green Fluorescent Protein / gClqBP / 受容体ヘテロ二量体

Research Abstract

受容体の細胞内局在、およびその制御機構を解析するために、アドレナリン受容体をモデルとし、定量的実験が可能なフローサイトメトリーと、画像として可視化が可能なレーザー共焦点顕微鏡を組み合わせ解析を行ってきた。
現在までに、受容体の蛍光標識にはエピトープタグ、GFP(Green Fluorescent protein)を融合した受容体コンストラクトを作製し、細胞内局在、輸送機構の直接的な可視化および、Real-timeでの観察を可能にした(Awaji et al, Mol Endcrinol 1998)。さらに、受容体蛋白質を誘導発現できる培養細胞系を作製し、これを用いて局在、輸送機構に関する薬理学的な解析を行った(Hirasawa et al.Brit J Pharmacol 1998)。また、局在の制御に関与すると考えられる蛋白質の検索のため、yeast two-hybrid法を用いα1Bアドレナリン受容体に結合する蛋白質としてgClqBPの単離に成功し、その結合部位のモチーフを明らかにした(Zjxu et al J Biol Chem 1999)。
本年度は、アドレナリン受容体間、および他の7回膜貫通型受容体として、バソプレッシンVlA受容体との間の相互作用について解析を行った。エピトープタグと、GFPを付けた受容体コンストラクトを用い、相互作用を解析したところ、受容体サブタイプによって相互作用を起こす組み合わせに差のあることを見いだした。検出された、受容体ヘテロ二量体もしくは、多量体を詳細に解析したところ、この相互作用は、アゴニスト刺激、アンタゴニスト刺激により変化は認められなかった。また、GFPに替えてpH感受性を持つGFP変異型プローブを融合した受容体コンストラクトを用いることで、受容体近傍の微小環境を可視化することにも成功した。

Research Products

• [Publications] Shinoura H,Take H,Hirasawa A et al.: "Key amino acids of vasopressin Vla receptor responsible for the species difference in the affinity of OPC-21268."FEBS Letters. 466. 255-258 (2000)
• [Publications] Homma N,Hirasawa A et al.: "Both α1A-and α1B-adrenergic receptor subtypes couple to the transient outward current(ITO)in rat ventricular myocytes."Br.J.Pharamacol.. 129(6). 1113-1120 (2000)
• [Publications] Yamauchi J,Itoh H et al.: "Involvement of c-Jun N-terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase in α1B-adrenergic receptor/G a q-induced inhibition of cell proliferation."Biochem.Biophys.Res.Commun. (in press).