分子進化工学を用いた環境調和型水素生産システムの開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12780417
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 矢野 和義 東京大学, 先端科学技術研究センター, 助手 (40262109)
• Keywords: 水素 / ヒドロゲナーゼ / hypF / 大腸菌

Research Abstract

水素生産に関わるヒドロゲナーゼ(Hyd3)は、翻訳後様々なプロセシングを経て活性を持つようになる。HypFはヒドロゲナーゼ活性に必須の要素であるが、その機能は不明で、このプロセシングの過程に関与している可能性がある。そこで、ヒドロゲナーゼの欠損株(MC4100Δhya,Δhyb,ΔhycE)を超音波破砕したものと、hypFの欠損株(MC4100ΔhypF)を超音波破砕したものとを混合し、ヒドロゲナーゼ活性が回復するかどうかを観察することにより、ヒドロゲナーゼが正常にプロセシングされるかどうかについて検討した。電子のアクセプターとしてbenzyl viologen(BV)を用い、還元BVを分光光度計で追跡することにより、ヒドロゲナーゼ活性を測定したが、ヒドロゲナーゼ活性の顕著な回復は見られなかった。このことから、ヒドロゲナーゼ活性の回復にはHypFだけではなく他の関連タンパク質の存在が必要である可能性が示唆された。一方、ヒドロゲナーゼが本当に正しいプロセシングを受けていないことを今後抗ヒドロゲナーゼ抗体を使って調べる必要がある。
次に、HypFの存在によってヒドロゲナーゼが活性を持つ様子を、ウェスタンブロッティングによって観察するために、抗体を作製することにした。抗原性が高いと予想される部位を抗原ペプチドとしてペプチド合成機で合成し液体クロマトグラフィーで精製した。これを用いてウサギを免役し抗HypF抗体を作製した。嫌気培養した大腸菌と大量発現したHypFをサンプルとしてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、上記の抗体を用いてウェスタンブロッティングを行ったところ、大量発現したHypFからはシグナルが得られたが、大腸菌からは該当するバンドは検出されなかった。今後は大量発現したHypFを抗原としてより結合能の高い抗体を得る。

Research Products

• [Publications] Miyachi et al.: "Application of polymer-embedded proteins to fabrication of DNA array"Biotechnology and Bioengineering. 69. 323-329 (2000)
• [Publications] Kato et al.: "Interaction of three-way junction with steroids"Nucleic Acid Research. 28・9. 1963-1968 (2000)
• [Publications] Kato et al: "Bioassay of bile acids using an enzyme-linked DNA aptamer"The Analyst. 125. 1371-1373 (2000)
• [Publications] Kato et al.: "In vitro selection of DNA aptamers which bind to cholic acid"Biochimica et Biophysica Acta. 1493. 12-18 (2000)