オンコジーン産物タンパク質Vavの分子認識機構に関する構造生物学的研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12780446
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 小椋 賢治 北海道大学, 薬学研究科, 助手 (50270682)
• Keywords: Vav / 構造生物学 / 核磁気共鳴分光法 / SH3ドメイン / シグナル伝達

Research Abstract

現在のところ,VavのSH3-SH2-SH3ドメイン領域についての立体構造解析の第一段階として,各ドメイン単位での構造決定および結合標的ペプチドとの相互作用を順次おこなっているところである.
[N末端側SH3ドメイン]このSH3ドメインは,その内部にSH3ドメインの結合標的とされている"プロリンに富む領域"を含んでいる.このSH3ドメインの安定同位体ラベル試料を作成し,核磁気共鳴スペクトルを測定したところ,RTループ部位に位置するプロリン残基のイミド結合が,溶液中にてシス-トランス異性化平衡にあることを見出した.この異性化を生じているプロリンをグリシンに置換したミュータントタンパク質を作成し,その立体構造を核磁気共鳴分光法により,精密に決定した.その結果,"プロリンに富む領域"はポリプロリンII型ヘリックスを形成してタンパク質表面に結合していることがわかった.その結合部位は,一般的なSH3ドメインが標的タンパク質を結合する領域の近傍であるが,完全に一致しているわけではなかった.この研究成果は現在,論文投稿中である.
[C末端側SH3ドメイン]このSH3ドメインは,N末端側SH3ドメインとは異なり,一般的なSH3ドメインの特徴を保持している.現在,このSH3ドメインとその結合標的タンパク質であるhnRNP-K由来の"プロリンに富む領域"を含むペプチドの複合体の立体構造解析を進めているところである.はじめに,大腸菌遺伝子操作により,タンパク質大量発現システムを構築した.つぎに,目的タンパク質の精製プロトコルの確立,および核磁気共鳴分光計での至適測定バッファー条件をスクリーニングによって見出した.同位体ラベルタンパク質を作成した.核磁気共鳴スペクトルの滴定実験により,ペプチドとの結合を確認した.現在,タンパク質-ペプチド複合体の立体構造決定のためのスペクトル測定を開始したところである.