染色体DNA複製様式に共役した核クロマチン構造変化の検出とその制御機構の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12780466
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 佐藤 憲子 東京大学, 医科学研究所, 助手 (70280956)
• Keywords: 染色体複製 / 細胞周期 / 核構造 / PCNA / Cdc7-ASK

Research Abstract

本年度は核内で複製反応等の染色体反応の可視化による検出方法の確立を目指した。固定した標本の場合には複製fociを別々の特定の時間に取り込ませておいたIdUとCldUを染め分けることによって時間的にどのように複製反応が染色体上で進行しているかを観察した。また、生細胞観察においても、種々のGFP融合蛋白質を用いて一細胞レベルでの挙動を検出することを試みている。現在のところ、GFP-PCNAによってS期のモニタリングが可能であると考えている。安定に発現させたGFP-PCNAは分裂期には細胞質に散在するが、TelophaseからG1期に至る過程で核に集積し、G1期が進行するにつれて特定の場所にfociをつくる。S期の進行に伴い、S期の初期中期においてはGFP-PCNAの集積するシグナルは比較的強く、また特定の場所に限局している。後期にヘテロクロマチン領域にシグナルが局在し、G2期に進むに従い、限局していたシグナルが消失する。生細胞観察についてはまだ技術的に未熟な点があるので現在改良中である。複製起点の活性化に必要と考えられているCdc7-ASKキナーゼについても、GFP融合蛋白質を作成しており、このキナーゼの局在とPCNAの挙動との関係を検討中である。また、分化誘導の可能な細胞での細胞周期進行のモニタリングも進行中である。特に生細胞観察の時に、2種類以上の蛋白質を必ず発現できるようなベクターの構築、あるいは誘導依存性に蛋白質が発現するような系を導入する必要があると考え、現在準備している。