2000 Fiscal Year Annual Research Report
リポキシゲナーゼにおける非ヘム鉄リガンドの反応修飾機能の解析
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12780475
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
地阪 光生 島根大学, 生物資源科学部, 助教授 (60243424)
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| Keywords | リポキシゲナーゼ / 非ヘム鉄リガンド / アラキドン酸 / リノール酸 |
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| Research Abstract |
リポキシゲナーゼ(LOX)の非ヘム鉄リガンドの反応修飾機能を詳細に解析するために、本年度の研究計画は主に基盤情報の確立に関わるものであった。1.8S-LOX及びその第5鉄リガンド変異体の大量調製系の確立:野生型のS(Ser)体、及び変異体の、N(Asn)体、H(His)体及びA(Ala)体の大腸菌での発現に成功した。さらに、Ni-アフィニティークロマトグラフィーを組合わせ、各酵素の迅速な調製系を確立した。2.各酵素標品の反応特性の解析:大腸菌での発現系の確立には予想外に時間を要したため、先ず、HeLa細胞での小スケールの発現と解析を試みた。T7RNAポリメラーゼ遺伝子を組込んだワクシニアウイスルとの共トランスフェクションにより、酵素活性を検出できる程度に発現させることができた。その結果、N体及びH体はS体と同等の活性を示した一方、A体もまた十分な酵素活性を保持していることが判明した。これはLOX活性の発現に、第5非ヘム鉄リガンドは本質的に必要ないことを示唆している(ABB,in press)。大腸菌で得られた各酵素標品の反応特性を検討したところ、各々のKmは同程度であるが、反応速度が大きく異なることが明かとなった。これに対する第5鉄リガンドの効果の詳細は引き続き検討中である。3.各酵素標品の鉄含量の測定:各酵素標品が相当量得られることとなり、より簡便な発色法による鉄含量の測定が可能となった。A体を含め、変異体はすべて野生型と同等量の鉄を含有しており、8S-LOXの第5鉄リガンドが鉄の保持性に影響しないことが判明した。4.8S-LOXの新規反応性の検討と反応生成物の同定:8S-LOXでは、反応の一次産物である8S-HPETEが生成した後、わずかながらより極性の高いトリエン化合物の生成が確認された。本生成物の同定、及び各変異体での生成は現在検討中である。
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