構造情報に基づく抗原抗体反応の精密解析と特異性・親和性を決定する因子の抽出

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12780486
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 津本 浩平 東北大学, 大学院・工学研究科, 助手 (90271866)
• Keywords: 抗原抗体相互作用 / 蛋白性抗原 / X線結晶構造解析 / 熱力学的解析 / 分子認識 / 変異体 / 非共有結合 / 蛋白質間相互作用

Research Abstract

蛋白質間相互作用をより深く理解するには、静電相互作用、疎水的相互作用、局所的構造変化(local folding)、界面に残存し相補性を補完する水分子という四つの視点から議論し、特異性・親和性を決定する要因を抽出することが必要である。そのためには、結晶構造解析を中心とする構造情報を、熱力学的解析あるいは速度論的解析と組み合わせて総合的に議論することが最も有効である。本研究では、モデルとなる蛋白性抗原と抗体可変領域の相互作用を取り上げ、(1)疎水的相互作用、(2)静電的相互作用(塩橋・水素結合)、(3)局所的構造変化に関与するアミノ酸残基、そして(4)界面に残存する溶媒分子に着目し、微生物を用いた発現系を駆使して、変異導入を施した抗原あるいは抗体を用いた相互作用について、構造解析・熱力学的解析を中心とした精密解析を行い、抗原抗体相互作用における特異性・親和性がどのような因子によって創出されているかを明らかにすることを目的としている。今年度の実績は以下の通りである。(1)変異抗体と野生型抗原複合体の結晶構造解折:(1)HELのLys97と形成する塩橋を欠損させた変異体(H-Asp32Ala、Asp96Ala、二重変異体)、(2)Tyrの水酸基を欠損した変異体(H-Tyr33Phe、H-Tyr50Phe、H-Tyr53Phe)、(3)芳香環と正荷電間に見出されるアミノアロマティック相互作用を欠損させた変異体(H-Tyr58Ala)、(4)抗原との誘導適合に重要な役割を果たしている重鎖Tyr53の側鎖を欠損させた変異体(H-Tyr53Ala)と野生型抗原との複合体について、構造解析に相応しい結晶を得、これらの結晶構造を精密化し、得られた構造情報を基に、熱力学的パラメーターの変化との関連を議論した。(2)三者複合体間の界面における水分子の役割の考察:野生型抗体と野生型抗原複合体の結晶構造解析によれば、特に軽鎖の抗原認識領域において、水分子が6個とどまっており、これらが抗原抗体双方のアミノ酸残基と水素結合ネットワークを形成していた。変異抗体(L-Tyr50Phe、L-Asn92Ala、L-Tyr96Phe)との野生型抗原との相互作用について、生化学的並びに熱力学的に解析した。また、複合体について、構造解析にふさわしい結晶を作製した。(3)重鎖軽鎖間相互作用の役割:重鎖軽鎖間の相互作用、特にヘテロ二量体の相対的な位置が、抗体の抗原特異性に重要な役割を果たしている可能性が示されている。H-Lys39-L-Gln38、H-Trp103-L-Pro44に着目し、これらのAla変異体を作製し、相互作用を生化学的並びに熱力学的に解析を行い、結晶の作製も試みた。

Research Products

• [Publications] Nishimiya et al.: "Thermodynamic consequences of grafting enhanced affinity toward a mutated antigen onto an antibody : The case of anti-hen lysozyme antibody, HyHEL-10"The Journal of Biological Chemistry. 275. 12813-12820 (2000)
• [Publications] Asano et al.: "Functional construction of anti-mucin core protein (MUC1) antibody MUSEII variable regions in a bacterial expression system"The Journal of Biochemistry. 127. 673-679 (2000)
• [Publications] Arai et al.: "Fluorolabeling of antibody variable domains with green fluorescent protein variants : Application to an energy transfer-based homogeneous immunoassay"Protein Engineering. 13. 369-373 (2000)
• [Publications] Ueno et al.: "Monoclonal antibody-mediated inhibition of hepatitis C virus NS3 protease : Probing NS4A-induced conformational change at protease active site."Journal of Virology. 74. 6300-6308 (2000)
• [Publications] Takemura et al.: "Functional Fv fragment of an antibody specific for CD28 : Fv-mediated costimutation of T cells"FEBS Letters. 476. 266-271 (2000)
• [Publications] Ueda et al.: "Cell-growth control by monomeric antigen : the cell surface expression of lysozyme-specific Ig V-domains fused to truncated EPO receptor."Journal of Immunological Methods. 241. 159-170 (2000)
• [Publications] Tsumoto and Kumagai: "Thermodynamic consequences of single-mutation on association of an antibody with its specific antigen : The case of anti-hen lysozyme antibody, HyHEL-10"Chemistry Letters. 1066-1067 (2000)
• [Publications] Takemura et al.: "Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding system"Protein Engineering. 13. 583-588 (2000)
• [Publications] Yoda et al.: "Folding-unfolding of goat alpha-lactalbumin studied by stopped-flow CD and molecular dynamic simulations"Proteins ; Struct.Funct.Genet.. 42. 49-65 (2001)
• [Publications] Arai et al.: "Demonstration of a homogeneous noncompetitive immunoassay based on bioluminescence resonance energy transfer"Analytical Biochemistry. 289. 77-81 (2001)
• [Publications] Nakamura et al.: "Panning of phage VH library using nitrocellulose membranes-application to selection of human VH library"The Journal of Biochemistry. 129. 209-212 (2001)
• [Publications] Kasai et al.: "Fv fragment of an antibody specific for hepatitis C NS3 protease domain : The sequence analysis, bacterial expression, and functional characterization."Biochem.Biophys.Res.Commun.. (印刷中). (2001)
• [Publications] 津本 ら: "抗体ドメインの効率的な巻き戻し法"生物物理. 40. 274-276 (2000)
• [Publications] 津本 ら: "変異体を用いた抗原抗体相互作用の熱力学的、速度論的解析"人工知能学会KBS研究会. 49. 83-88 (2000)
• [Publications] 熊谷,津本: "金属表面特異的ペプチドの選択-半導体と生命分子の接点"化学. 55. 58-59 (2000)
• [Publications] 津本 ら: "不溶性顆粒からの蛋白質の巻き戻し"蛋白質核酸酵素. (印刷中). (2001)
• [Publications] 津本,熊谷: "ファージディスプレーを用いた新規バイオ分子の選択と応用"BIOINDUSTRY. (印刷中). (2001)
• [Publications] 熊谷,津本: "ファージライブラリーによる抗体産生"文光堂. 180 (2000)
• [Publications] 熊谷,金谷 ら: "生命工学"共立出版. 350 (2000)
• [Publications] Kumagai and Tsumoto: "Encyclopedia of Life Sciences"Blackwell(印刷中). (2001)
• [Publications] 津本,熊谷: "生体ナノマシンの分子設計"共立出版(印刷中). (2001)
• [Publications] 津本: "抗体工学(生命工学)"共立出版. 50 (2000)