大量・高速なマッピングシステムを目指した電極による遺伝子型決定法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12780630
• Research Institution: National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
• Principal Investigator: 山下 聡 国立がんセンター, 発がん研究部, 研究員 (80321876)
• Keywords: 遺伝子マッピング / AP-PCR / ハイブリダイゼーション / 電極 / RDA / high throughput

Research Abstract

申請者らの考案した、arbitrarily-primed-representational difference analysis(AP-RDA)マーカーは、多数の個体の高速な遺伝子型決定に適するゲノムマーカーである。さらなるhigh throughputな遺伝子マッピングシステムを構築するために、AP-RDAマーカーとゲノムDNAのAP-PCR産物とのハイブリダイゼーションを、電極と、二本鎖DNAと結合しかつ電気分解される化合物(electrophore)とを用いて、電流の計測により検出することを目的とした。本年度の成果として以下の結果を得た。
1.30個のAP-RDAマーカーの塩基配列を決定し、配列の一部から、20〜60merの一本鎖DNAのAP-RDAマーカーを合成した。
2.従来の化学発光法を用いて、1で合成した一本鎖AP-RDAマーカーのハイブリダイズを検証した。その結果、AP43b A11マーカーの配列の一部の40merが、AP43bA11マーカーの全長と同様にハイブリダイズすることがわかった。
3.2で検証した40mer一本鎖AP-RDAマーカー(AP43bA11-1)をmercaptohexyl基を介して金電極に固定した。金電極を、一本鎖に変性したAP-PCR溶液に2時間浸し、ハイブリダイゼーションを行った。二本鎖DNAと結合するelectrophoreとしては、Hoechst33258を用いた。洗浄後、サイクリックボルタメトリーを用いて電流を計測することにより、電極上に残った二本鎖DNAを定量した。その結果、感度が不十分であるため、再現性よく、安定してハイブリダイズを検出するには至らなかった。
今後、ハイブリダイゼーションの条件、使用するelectrophoreを改良することにより、安定したハイブリダイゼーションの検出を目指す。