酸化LDL受容体(CD36)欠損動物の開発と動脈硬化発症機構解明への応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12835005
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 山下 静也 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (60243242)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平野 賢一 大阪大学, 医学系研究科, 助手 ; 酒井 尚彦 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (80294073) ; 冨山 佳昭 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (80252667) ; 西田 誠 大阪大学, 医学部・附属病院, 医員
• Keywords: 酸化LDL / 受容体 / 粥状動脈硬化 / CD36 / 長鎖脂肪酸 / スカベンジャー受容体

Research Abstract

CD36は88kDの糖蛋白で血小板、単球、マクロファージ、脂肪細胞の細胞膜に存在し、コラーゲンやトロンボスポンジンの受容体であることが報告されていた。私共はCD36欠損症を発見し、遺伝子変異を同定するとともに、CD36欠損症患者のマクロファージを用いた実験により、患者由来マクロファージでは酸化LDLの結合が約50%低下していたことから、CD36がマクロファージにおける酸化LDLの受容体として粥状動脈硬化の発症過程で重要であること明らかにした。また、ヒト大動脈の粥状硬化巣でCD36が強く発現し、特に泡沫化の強いマクロファージでの顕著な発現が認められ、スカベンジャー受容体Class A(SRA)の分布とは異なることを見出した。本研究ではかかるCD36に関する細胞及び分子生物学的研究を基盤に、発生工学的手法によりCD36ノックアウトマウスの作製を試みた。マウスCD36cDNAをプローブとしてマウスC129 genomic libraryをスクリーニングし、ゲノムDNAを取り、ターゲッテイングベクターpGKNEOのNeo耐性遺伝子の上流及び下流にエクソンを分断するように5-10kbのゲノム遺伝子断片を挿入し、ターゲッテイングコンストラクトを完成させた。このターゲッテイングコンストラクトを直線化し、エレクトロポレーションによりES細胞に導入し、Neomycinによりスクリーニングして耐性を獲得した細胞を選択した。すでに我々は、サザンブロット法により目標部位に相同染色体組換えを起こしたことを確認したES細胞を得ている。さらに、このES細胞をマウスにマイクロインジェクションし、現在キメラマウスの作製を行った。現在、これらの交配によりCD36欠損マウスを樹立中であり、今後CD36欠損マウスの脂質代謝プロフィール、腹腔マクロファージの機能解析、動脈硬化病変などについて検討の予定である。また、SRAノックアウトマウスとの交配によりダブルノックアウトマウスを作成し、動脈硬化惹起性であるアポEノックアウトマウスやLDL受容体ノックアウトマウスとの交配により、CD36欠損が動脈硬化発症に及ぼす影響について検討する。一方、CD36欠損症例の臨床的特徴について、26例の患者の解析を行った。その結果、予想に反してCD36欠損症例では高トリグリセリド血症、高レムナント血症を中心とした高脂血症を合併し、グルコースクランプ法にてインスリン抵抗性が存在すること、また血圧の上昇も認められた。従って、CD36欠損はインスリン抵抗性やマルチプルリスクファクター症候群の新しい遺伝的基盤として重要であることが明らかになった(Lancet 2001に報告)。

Research Products

• [Publications] K.Miyaoka,T.Kuwasako et al: "CD36 deficiency associated with insulin resistance"Lancet. 357. 686-687 (2001)
• [Publications] M.Janabi,S.Yamashita et al: "Oxidized LDL-induced NF-kB activation and subequent expression of proinflammatory genes are defective in monocyte-derived macrophages from CD36-deficient patients"Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20. 1953-1960 (2000)
• [Publications] S.Nozaki,S.Yamashita et al.: "CD36 mediates long-chain fatty acid transport in human myocardium : complete myocardial accumulation defect of radiolabeled long-chain fatty acid analog in subjects with CD36 deficiency"Mol Cell Biochem. 192. 129-135 (1999)
• [Publications] A.Nakata,M.Nishida et al.: "CD36, a novel receptor for oxidized low density lipoproteins, is highly expressed on lipid-laden macrophages in human atherosclerotic aorta"Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19. 1333-1339 (1999)
• [Publications] K.Hirano S.Yamashita et al.: "Expression of human scavenger receptor class B type I (SR-BI) in cultured human monocyte-derived macrophages and atherosclerotic lesions"Circ Res. 8. 108-116 (1999)
• [Publications] T.Nakagawa,,S.Yamashita et al.: "Oxidized LDL increases and interferon-g decreases expression of CD36 in human monocyte-derived macrophages"Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18. 1350-1357 (1998)