マメ科植物と窒素固定根粒菌との共生系を利用したファイトレメディエーション

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12875155
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 室岡 義勝 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (60029882)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 誠 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (30291933)
• Keywords: レンゲソウ / 根粒菌 / バクテロイド / メタロチオネイン / 重金属 / ファイトレメディエーション

Research Abstract

マメ科植物と根粒菌との共生関係を利用して、生物的窒素固定能に加えて重金属集積能等を付与した多機能共生系の優れたモデル系を構築する目的で下記の研究を行った。
1)緑肥植物、レンゲソウヘの組み換え根粒菌の感染とその根粒形成:
グラム陰性菌で複製可能なpBBRおよびpRKベクターを用いて、先に筆者等がレンゲソウ根粒より分離同定した根粒菌、Rhizobium huakuii subsp. rengei B3株を形質転換した。このベクターに、最近大腸菌で大量発現させたヒトメタロチオネイン 4量体遺伝子を組み込み、前年度取得したバクテロイド中で発現するプロモーターの下流に組み込んで、レンゲソウの根粒菌内でメタロチオネイン遺伝子を高発現させた。
宿主側の緑肥植物、レンゲソウ(Astragallus sinicus cv. Japan)にメタロチオネイン遺伝子を導入した根粒菌を感染させ、試験管内で根毛内に根粒を形成させた。バクテロイドで発現するnifのプロモーター下流に組み換えたメタロチオネイン遺伝子を導入した根粒菌を感染させた植物体では、対照区の植物体と比較してカドミウムの吸収含有量が増大した。
2)レンゲソウヘのメタロチオネイン遺伝子の導入:
筆者らは先に、アグロバクテリウム・リゾゲネスの系を用いて、レンゲソウの根にGUS遺伝子を発現させた。さらに、昨年度アグロバクテリウム・チュメファシエンスを用いたヴァキューム・インフイルトレーション法によるインプランタ形質導入に成功した。そこで、この植物発現用ベクターにメタロチオネイン遺伝子を組み込み、先のアグロバクテリウムの導入系を用いて、レンゲソウに感染させた。メタロチオネイン遺伝子の有無を2,700のT1植物体で確認したが、遺伝子を保持している個体は存在しなかった。そこで、現在、再分化系での導入を進めている。

Research Products

• [Publications] S.-H.Hong: "High yield expression and single step purification of human thionein/ metallothionein"Protein Expression and Purification. 21(1). 243-250 (2001)
• [Publications] H.Kobayashi: "DNA synthesis and fragmentation in bacteroids during Astragalus sinicus root nodule development"Biosc. Biotech. Biochem.. 65(3). 510-515 (2001)
• [Publications] K.Nanda: "Characterizations of acetic acid bacteria in traditional acetic acid fermentation of rice vinegar (komesu) and unpolished rice vinegar (kurosu) produced in Japan"Applied and Environmental Microbiology. 67(2). 986-990 (2001)
• [Publications] P.Kiatpapan: "Construction of an expression vector for propionibacteria and its use in production of 5-aminolevul inic ac id by Propionibacterium freudenreichii"Appl. Microbiol. Biotechnol.. 56. 144-149 (2001)
• [Publications] Y.Murooka: "Genetic design of stable metal-binding biomolecules, oligomeric metallothioneins"Biocatalysis and Biotransformation. 19. 399-412 (2001)
• [Publications] P.Kiatpapan: "Heterologous expression of a gene encoding cholesterol oxidase in probiotic strains of Lactobacillus plantarum and Propionibacterium freudenreichii under the control of native promoters"J. Biosci. Bioeng.. 92(5). 459-465 (2001)
• [Publications] S.Nishikawa, Y.Murooka: "Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. Vol.18"Intercept, Andover, England(ed. S. E. Harding). 149-170 (2001)