Rhodococcus属細菌の線状プラスミドを利用したベクター系の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12876018
• Research Institution: Nagaoka University of Technology
• Principal Investigator: 福田 雅夫 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (20134512)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 政井 英司 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (20272867)
• Keywords: 線状プラスミド / 複製機構 / ポリ塩化ビフェニル / 環境汚染 / 不和合性 / Rhodococcus

Research Abstract

Rhodococcus sp. RHA1株に存在する線状プラスミドの複製起点についての解析を行い、以下の結果を得た。
RHA1株の持つ3種の線状プラスミドのうち、pRHL3の複製起点を含むと思われる6-kb BglII断片を取得し、その塩基配列の決定を行った。その結果、Rhodococcusと近縁なMycobacteriumにおいてプラスミドの複製に関与するタンパク質と優位な相同性を示すopen reading frame(ORF)が見いだされたため、このORFをrep1と命名した。rep1は1020bpからなり、340アミノ酸をコードしている。Rep1が相同性を示したタンパク質は線上プラスミドの複製に関与するものに加えて、環状プラスミドの複製に関与するものもあったことから、両タイプのプラスミドの複製様式に共通性があることが示唆された。rep1遺伝子の上流には他のプラスミドで不和合性に関与することが示唆されているDNA配列が保存されていたが、複製開始時にRepタンパク質が結合すると考えられているアイテロンと呼ばれる配列と相同性を持つ配列は認められなかった。次に、複製に必要な最小領域を同定するためデリーションクローンを作成し、複製に関与する領域をrep1及び上記の保存配列を含む3-kb KpnI断片にまで縮小した。
また、取得に成功していないpRHL1及びpRHL3それぞれの片側の末端断片の取得も試みた。pRHL3DNAのPstI消化物に対して、取得済みの1.8-kb pRHL3末端断片をプローブに用いたサザン解析を行ったところ、1.8kbと3.2kbにハイブリダイズした。同様の実験をPstI消化したpRHLl DNAと取得済みの1.2-kb pRHL1末端断片を用いて行ったところ、1.2kb、2.2kb、5kbにハイブリダイズしたため、pRHL1は末端以外の部位に末端断片と相同性を持つ領域があることが示唆された。今後pRHL3の未取得末端をクローニングし単離した複製起点と組み合わせることで、線状ベクターの構築が可能になると考えられる。