2000 Fiscal Year Annual Research Report
生化学的アプローチによる難聴遺伝子の同定と病態の解明
| Project/Area Number |
12877273
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
|
| Research Institution | Jichi Medical University |
|---|
Principal Investigator |
川上 潔 自治医科大学, 医学部, 教授 (10161283)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 啓子 自治医科大学, 医学部, 講師 (10265241)
|
|---|
| Keywords | Eya蛋白質 / HeLa細胞 / グリセリン蜜度勾配遠心 / カラムクロマトグラフィー |
|---|
| Research Abstract |
HeLa細胞およびC2C12細胞から、核抽出液および細胞質抽出液を調製し、グリセリン密度勾配遠心にて蛋白質複合体を分画した。抗Eya1,Eya2,Eya3蛋白質抗体を用いてウエスタンブロットで各蛋白質の分布を解析したところ、核抽出液および細胞質抽出液の双方で高分子の複合体となったEya3を検出した。蛋白質の大量調製には、HeLa細胞が適しているので、HeLa細胞を大量培養する系を準備した。HeLa細胞の核抽出液をグリセリン密度勾配遠心で分画し、Eya3複合体が検出された画分を集め、MonoQやMonoSカラムを用いて分離精製を試みたところ、MonoQでは、0.3MKCl付近に、また、MonoSではフロースルー画分にEya3複合体を検出した。完全精製にはまだ、2-3回のカラム精製が必要と考えられるので、精製法をさらに検討している。
一方、Eya複合体のアフィニティー精製を可能とするために、Eya1,Eya2,Eya3HA融合蛋白質を発現する形質転換株をHeLa細胞で樹立した。抗HA抗体で各Eya蛋白質を検出したところ、一部の融合蛋白質が、内在性Eya複合体とほぼ同じ分子量の高分子複合体になっていることが確認された。形質転換細胞株を大量に調製し、グリセリン密度勾配遠心で、高分子複合体画分を集め、抗HA抗体カラムを用いて精製を試みた。予備的な実験結果から、数本の蛋白質を含む複合体が溶出されることを確認した。
|
-
[Publications] Muto,S.: "Intracellular Na^+ directly modulates Na^+,K^+-ATPase gene expression in normal rat kidney epithelial cells."Kidney Int.. 57. 1617-1635 (2000)
-
[Publications] Kawakami,K.: "Six family genes-Structure and function as transcription factors and their roles in development."BioEssays. 22. 616-626 (2000)
-
[Publications] Kobayashi,M.: "Expression of three zebrafish Six4 genes in the cranial sensory placodes and the developing somites."Mech.Dev.. 98. 151-155 (2000)
-
[Publications] Ozaki,H: "Six4,a putative myogenin gene regulator,is dispensable for mouse embryonal development."Mol.Cell.Biol.. (in press). (2001)
-
[Publications] Kawakami,K.: "Control and diseases of sodium dependent transport proteins and ion channel"Elsevier. 4 (2000)
